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- 【导读】RNA提取RNA提取试剂盒简介:RNA是一种重要的遗传信息分子,因此完整RNA的提取和纯化,是进行Northern杂交、RT-PCR、定量PCR等RNA相关研究的重要前提。RNA提...
RNA提取
RNA提取试剂盒简介:
RNA是一种重要的遗传信息分子,因此完整RNA的提取和纯化,是进行Northern杂交、RT-PCR、定量PCR等RNA相关研究的重要前提。
RNA提取的原理与方法:
细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,这三类RNA都存在于细胞质中,因此不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质,Z终获得高纯RNA产物的过程。RNA提取流程
一、样品处理
从各种不同来源样品(如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞),或同一来源样品的不同组织(如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等)中提取高质量的RNA,因细胞结构及所含的成分不同,样品预处理的方式也各有差异。针对常用的提取材料,下面简单介绍常规样品预处理方法,若想了解具体操作步骤,请参照各类型样品RNA提取操作步骤。
提取样品的要求
Z好使用新鲜样品或取样后立即在低温(-20℃或-70℃)冷冻保存的样品,避免反复冻融,因为这会导致提取的RNA降解和提取量下降。样品预处理方式
植物材料液氮研磨
动物材料匀浆、液氮研磨
培养细胞蛋白酶K处理
细菌溶菌酶破壁
酵母酵母破壁酶或玻璃珠处理
二、细胞裂解
异硫氰酸胍/苯酚法
异硫氰酸胍/苯酚法是一种传统的RNA提取方法,适用于大部分动植物材料,但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离,并将RNA释放到溶液中,采用酸性酚/混合液抽提,低pH值的酚将使RNA进入水相,而蛋白质和DNA仍留在有机相,从而可以完成RNA的提取工作。
Solarbio公司的TRIquick和总RNA提取试剂盒就是基于异硫氰酸胍/苯酚法开发的一种总RNA提取试剂和试剂盒。TRIquick法应用非常广泛,适用于包括动物组织、微生物材料、培养细胞等在内的各类动物性材料,同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料,如幼苗、幼叶等。而总RNA提取试剂盒法主要应用在动物组织和培养细胞的RNA提取中,这种方法采用吸附性材料来纯化RNA,因此与TRIquick法相比,总RNA提取试剂盒提取RNA具有纯度更高的特点。
胍盐/β-巯基乙醇法
适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。在这种方法中,胍盐使细胞充分裂解,β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以YZRNase的活性,保护RNA不被降解。三、RNA纯化及获得
纯化要求
RNA样品中不应存在对酶(如逆转录酶)有YZ作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。纯化方法及沉淀
1、有机溶剂抽提法
抽提:在使用RNA提取试剂进行RNA提取时,常使用进行抽提,以去除蔗糖、蛋白等杂质,并促进水相与有机相的分离,从而达到纯化RNA的目的。沉淀:抽提RNA后,一般采用异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇,室温沉淀20-30分钟,高速离心,可获得RNA沉淀。
洗涤沉淀:加入无RNase的75%乙醇,将RNA沉淀振荡悬浮,使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心10-30分钟,再次沉淀RNA。离心后,小心倒掉上清(注意不要倒出RNA沉淀),随后快速离心1-2秒,将残留在管壁上的乙醇收集到管底后,用小枪头吸净,超净台中风干1-2分钟(注意不要晾得太干,否则RNA沉淀不易溶解)。
溶解沉淀:加入适量的RNase-freeddH2O溶解RNA沉淀。
2、硅基质吸附法
随着实验方法的改进,现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有:硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸,使用方便、快捷,不使用有毒溶剂如苯酚等优点,成为核酸纯化的shou选。
Solarbio公司总RNA提取试剂盒就是采用硅基质吸附达到RNA分离纯化目的。通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合,而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱,盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤,Z后用RNase-freeddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来。
一些特殊组织的RNA提取
纤维组织:心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低,单位重量的组织中RNA含量较低,建议增加起始量。此外,一定要在液氮中将组织彻底磨碎。蛋白/脂肪含量高的组织:脑或植物脂肪含量高,酚抽提后,上清含白色絮状物。必须用再次对上清进行抽提。
核酸RNase含量高的组织:脾、胸腺等组织的核酸和RNase含量很高。在液氮中研磨,再快速匀浆,能有效灭活RNase,如加入裂解液后过于粘稠,酚抽提不能有效分层,则加入更多裂解液可以解决此问题。多次酚抽提可以去除更多残留的DNA。如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成,表明可能有DNA污染,可以在核酸溶解后用酸性酚再次抽提或者用DNaseI消化,去除DNA污染,植物组织和真菌组织:植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂,一般选择在液氮条件下对样品进行研磨,以避免内源RNase降解RNA。如果RNA降解问题不能解决,大多数情况下是样品中含有的杂质所致。许多植物和真菌中所含杂质如多糖、多酚等都会残留,因为这些杂质分子与RNA有一些相似性,可与RNA同时沉淀或者吸附,因此在植物和真菌组织的提取中,需要用一些特别的步骤或者特别的试剂来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。
四、RNA评价与鉴定
提取得到RNA溶液后,我们需要对RNA进行相关的质量检测,以确定它是否符合后续实验的要求。RNA用于不同的后续实验,对其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整且无酶等YZ物残留;Northernblot实验对RNA完整性要求较高,对酶反应YZ物残留要求较低;RT-PCR实验对RNA完整性要求不太高,但对酶反应YZ物残留要求严格。因此在进行不同的实验时应选择不同的方法纯化RNA,以达到Z佳的实验效果。
RNA得率检测分光光度计法
RNA得率有很强的组织特异性,不同组织RNA的丰度和RNA提取的难易程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说,可通过分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质(多肽、苯酚等)浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm处,1μg/mlRNA钠盐吸光度为0.025(光程为1cm),即OD260=1时,样品中RNA浓度为40μg/ml。通常分光光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的,因此RNA提取结束后,要根据大概产量稀释到适当浓度范围,再用分光光度计检测。按下面的公式计算总RNA浓度:
总RNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×40μg/ml
RNA纯度检测分光光度计法
通过OD260/280来检测RNA纯度,OD260/280作为参考值。
OD260/280在1.9-2.1之间,可以认为RNA的纯度较好;
OD260/280值小于1.8,则表明蛋白杂质较多;
OD260/280值大于2.2,则表明RNA已经降解;
OD260/280值小于2.0,则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙醇残留。
注意:如果用TE溶解或洗脱RNA,会使OD260/280值偏大。
RNA完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳
变性电泳:
我们可以通过RNA变性电泳,来鉴定RNA的完整性,但一般情况下常规电泳检测即可。
RNA变性电泳方法如下:
1、凝胶制备:1.2%琼脂糖凝胶
2、上样电泳
①电泳混合液的制备:
10×甲醛变性电泳缓冲液1.25ul
37%甲醛2.2ul
甲酰胺6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm离心5-10秒
④55℃加热15分钟
⑤加入2.5μl甲醛凝胶上样缓冲液,混合后离心5秒
⑥将样品加入点样孔
⑦在5V/cm的电压下电泳至溴酚蓝带跑到电泳槽ZY(20cm长电泳槽,95V电压,1小时左右)。
rRNA占总RNA的80-85%,在琼脂糖凝胶上可以清晰地看到28S(23S)和18S(16S)rRNA。如28SrRNA的量约为18SrRNA的两倍,说明RNA完整性较好。
常规电泳:
由于变性电泳操作步骤较为复杂,所以在要求不太严格的实验中,RNA的检测可以通过常规的琼脂糖凝胶电泳进行。一般1%左右的凝胶就可以。按常规电泳配制好凝胶和电泳溶液,总RNA在普通琼脂糖凝胶电泳上显示条带与变性电泳一致。
五、RNA的保护
与DNA提取实验相比,RNA的提取实验常常较为困难,这主要是由于RNA非常容易降解。而造成RNA降解的原因来自内因和外因两个方面。内因:RNA核糖残基的2’和3’位置带有羟基,易被水解;外因:生物体内和外部环境中存在大量RNase,并且RNase不易失活,高温后仍然能够正确折叠恢复活性。因此,从样品的储存、RNA的提取以及RNA提取完成后的保存,我们都需要格外小心,处处防范RNase对RNA的降解作用。下面,我们将介绍RNA提取过程中保护RNA的措施。
1、提取前的RNA保护
材料样品中的RNA保护:一般而言,在收集材料样品准备提取RNA时,我们首先应该选择新鲜的材料,取样后迅速液氮研磨或匀浆处理,以保证我们所要提取材料中的RNA本身是完整的。如果收集好材料后,不能马上进行RNA的提取工作,就需要先将材料保存好,冰冻材料保证低温储存,防止反复冻融,以保证材料中的RNA在保存过程中不被降解。液氮低温保存法是一种常用的保存方法。先将材料在液氮中速冻后保存于-70℃冰箱或直接保存在液氮中。
实验室中RNA提取工作区RNase的清除:自然界中的RNase含量非常丰富,在空气中会有许多RNase存在。因此,在RNA提取实验中应该辟出RNA提取专区,该区域要进行RNase的清除处理,同时要注意避免同其它实验区发生交叉污染。
实验耗材、玻璃器皿上的RNase的清除:
所有提取RNA要用到的耗材和器皿都要进行RNase清除处理。使用无RNase的塑料制品、枪头、移液器、电泳槽等避免交叉污染,实验台面等要彻底处理。RNA处在TRIquick试剂中是不会被RNase降解的,但提取后的继续处理过程中应使用不含RNase的塑料或玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时以上,塑料器皿可用DEPC处理后再高压灭菌,即可去除RNase。实验所用的试剂或溶液,必须确保无RNase。配制溶液应使用无RNase的水。
2、提取过程中的RNA保护
组织破碎过程中的RNA保护:选择合适的匀浆方法,尽可能减少匀浆的时间,保持低温匀浆。在进行细胞裂解之前,一般要先将组织块破碎。破碎所采用的方法主要有液氮研磨或匀浆处理。液氮研磨时注意不要让液氮挥发干净,因为液氮可以充分YZRNase,一旦液氮挥发干净,就可能造成内源RNase对RNA的降解作用。
细胞裂解过程中的RNA保护:选择合适的裂解液,裂解液的量要足够,裂解要充分。在裂解液加量一定的情况下,所加入的提取材料的量就应该按说明书中的比例加入,如果材料太多,会造成裂解不充分和RNaseYZ不充分的双重后果,从而使RNA的得率、完整性和纯度都受到破坏。
实验人员的注意事项:在提取RNA的过程中,实验操作者本身也应该注意相关问题。因为我们的手上、唾液中都会有大量的RNase存在,所以在进行RNA提取实验时,应该戴上口罩,并及时更换手套。这不仅是对RNA的保护措施,同的也是对实验操作者自身的保护。3、保存过程中的RNA保护
在经过从材料采集到RNA提取等一系列精心地准备和实验之后,我们终于得到了高质量的RNA,那么接下来的RNA保存就成为ZD问题,而其中Z关键的问题就是如何避免保存过程中的RNA降解。
RNAwait就是在RNA保存过程中常用的一种RNaseYZ剂,它能够GX去除溶液中可能存在的RNase污染,保证RNA完整性不受破坏。
4、后续实验中的RNA保护
RNA的提取归根到底只是一个基础实验,这就意味着我们还要用RNA来完成许多后续实验,例如:RT-PCR,Northernblot,体外转录和翻译等。那么在这些后续实验中,也需要对RNA进行持续的保护,RNasin就是在这类后续实验中的应用Z广泛的RNaseYZ剂。相关产品:
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- 2004-08-30 09:23:16
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