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- 【导读】SPA可为多种示踪物(如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白)所标记,应用较广泛的为酶标记SPA和金标记SPA技术。标记SPA常用的酶为HRP,可应用于间接法染色,SPA在PAP法中可代替桥...
SPA可为多种示踪物(如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白)所标记,应用较广泛的为酶标记SPA和金标记SPA技术。标记SPA常用的酶为HRP,可应用于间接法染色,SPA在PAP法中可代替桥抗体。
1.SPAHRP在间接法中的应用
由于SPA能结合IgG的Fc段,因此就成为天然的抗IgG,酶标记的SPA可代替酶标记的IgG抗血清,从而测定和定位组织内的IgG或免疫复合物,SPAHRP的染色步骤如下。
(1)石蜡切片常规脱蜡至水。
(2)3%H202处理15min,以YZ内源性过氧化物酶
(3)TBS洗3X3min。
(4)加diyi抗体,孵育30~60min,或4~C过夜。
(5)TBS洗3X3min。
(6)加适当的稀释的SPAHRP(1:100~1:400),孵育3060min。
(7)TBS洗3X3min。
(8)DAB显色510min。
(9)复染、脱水、封片。
2.SPA在PAP法中的应用
SPA除与标记物结合后用于代替第二抗体外,其本身可作为桥抗体用于PAP染色。与标记SPA相似,SPA可与多种动物的diyi抗体反应外,还可与多种PAP复合物反应,而不像PAP法需要与diyi抗体相同的动物制备的各种PAP复合物。由于SPA与Fc段和Fab段结合为亲和化学反应,不是抗原抗体的免疫反应,因而反应极为迅速,能大大减少实验时间。此法的敏感性不如PAP法,但背景染色要低于PAP法,而且较为方便。染色步骤如下。(1)4gm石蜡切片常规脱蜡至水,PBS洗3X3rain。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同,可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)。
(3)PBS洗3X3min。
(4)3%过氧化氢(Hz02)孵育10min(可省略),以阻断内源性过氧化物酶活性。
(5)PBS洗3X3min。
(6)20%蛋清[用0.01mol/L(pH7.3)PBS配制]孵育20min。
(7)PBS洗3X3min。
(8)10%非免疫性动物血清孵育10min(可省略),以减少非特异性背景,无需冲洗,只需吸去多余血清。
(9)滴加适当稀释的diyi抗体,37~C温育60min,或4~C过夜。
(10)PBS洗3X3rain。
(11)加SPA(1ug/mi),37~C温育30rain。
(12)PBS洗3X3rain。
(13)PAP复合物(兔或鼠)37~C温育30min。
(14)PBS洗3X3rain。
(15)0.04%DAB(含0.03%Hz02)显色5~10min
(16)复染,脱水,常规树胶封固,结果观察。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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