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最新更新：2021-07-19 11:56:39

RNA 甲基化修饰（m6A）研究技术及方案设计

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【导读】RNA甲基化是表观遗传学内容的重要内容之一，其中m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤，化学结构见图1）较为常见的一种修饰方式。m6A是一种动态可逆的修饰方式...

RNA甲基化是表观遗传学内容的重要内容之一，其中m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤，化学结构见图1）较为常见的一种修饰方式。m6A是一种动态可逆的修饰方式，在转录后调控中发挥作用，其在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译[1]等方面扮演重要角色，具有重要的研究意义（见图2）。

图1.6-甲基腺嘌呤化学结构及可逆反应过程

图2.动态修改的m6A修饰及介导的生物学功能[2]

M6A甲基化修饰是由一个多蛋白复合物介导产生，目前已知这个复合物的成分包括METTL3，METTL14和WTAP；而负责擦除甲基化修饰基团的则由去甲基化酶FTO和ALKBH5所承担。在细胞核中的HNRNPC负责识别m6A修饰基团，并介导mRNA前体的选择性剪接。而另外一个m6A识别蛋白HNRNPA2B1[3]则促进pri-miRNA加工成pre-miRNA。在细胞质中，不同的M6A位点识别蛋白介导不同的功能。YTHDF1和YTHDF3[4,5]识别m6A修饰mRNA，通过与起始因子及核糖体相互作用促进蛋白质翻译，eIF3识别蛋白也会直接绑定到mRNA5’UTR端的m6A位点参与翻译起始。而另外一个识别蛋白YTHDF2与m6A识别将导致mRNA的降解。目前还存在其他未知的m6A识别蛋白，相关研究的继续开展将有利于解开m6A在mRNA运输、翻译和存储等功能的谜团。

虽然RNA甲基化的研究在上世纪七十年代就开始，但是由于技术上的局限一直停滞不前，直到Z近几年在何川教授等团队的带领下，通过不断的技术创新和难点攻克，m6A等甲基化修饰的研究才不断取得突破性的研究成果。

关于m6A的研究方向，主要涉及m6A本身的修饰过程涉及的甲基化酶和去甲基化酶，以及m6A识别蛋白。这个研究方向的研究技术难度较大，涉及较多生化实验。其次是m6A修饰谱构建及作用机制，特别是构建疾病细胞模型或者发病组织的m6A修饰谱，涉及较为关键的MeRIP-seq(methylatedRNAimmunoprecipitationsequencing)高通量测序技术[6]。第三个方向是m6A修饰失衡介导相关基因异常（可变剪切、稳定性、翻译、miRNA调控）在所发挥的作用。第四个方向是通过大数据分析，利用公共数据资源对m6A修饰涉及的基因进行表达量统计，并进行共表达分析预测其可能调控的靶基因，进而进行功能验证。（见图3）

图3.m6A的主要研究方向

下面我们将ZD介绍其中一种研究方向的设计思路，并提供相应的技术服务和解决方案。

研究方向：构建转录组m6A修饰图谱

研究目的：构建目标样本的m6A修饰谱，揭示在特定生命过程或者疾病模型中的m6A图谱。

实验样本：细胞、组织、提取后的总RNA（限定有参基因组物种）

关键技术：meRIP-seq(methylatedRNAimmunoprecipitationsequencing)，也称m6A-seq

Z近几年来m6A研究迅速发展，正是得益于meRIP-seq技术的开发及应用。meRIP-seq高通量测序技术的出现，能够GX精确检测全转录组不同的RNA甲基化，是成功发现RNA甲基化机理及功能的关键技术。

MeRIP-seq技术将甲基化DNA免疫共沉淀(methylatedDNAimmunoprecipitation，MeDIP)技术、RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation，RIP)技术和RNA测序(RNAsequencing，RNA-seq)技术组合起来，高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA甲基化。MeRIP-seq技术采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序；同时需要平行测序一个对照(control)样本，对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。然后将免疫共沉淀(IP)样本和对照样本中的序列片段对比(或定位)到参考基因组/转录组上，检测RNA甲基化位点。对照样本测量对应RNA的表达量，本质上是RNA-seq数据(图4)[7]。

图4.MeRIP-seq技术检测m6A技术流程[4]

实验分组设置：

细胞模型实验组VS对照组，建议3:3

组织模型正常组VS疾病组，建议5:5

组内对照：IP组VSinput组*

注*：input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合，是必备的组分

测序模式：PE100/150

测序数据：3-6G

关键分析内容：m6A的基本特征

m6A修饰基本特征分析主要包括以下三个方面

特征一、peak在基因元件的分布

本分析主要通过对测序数据比对后，分析相关序列在基因不同原件的分布。主要方法是将5-UTR，CDS，3-UTR各划分为等长的20个bin，统计peak落在每个bin中peak的百分比。Peak和bin的overlap长度占50%以上就算落在了这个bin上。基因元件分布图见图5、图6：

图5Peak在元件中的分布曲线图。绿色表示CDS，蓝色表示UTR，灰色的细线表示start-coden的起始位点和stop-coden的终止位点

图6Peak分布条形图，横坐标表示各元件，纵坐标表示落在元件中的peak百分比

特征二、reads在基因元件的分布

找到富集区域（peak）后，统计reads在元件中的分布情况。针对peak，分别提取IP和Input在peak区间的reads，reads和peakoverlap上50%以上就算reads落在peak区间,同时normalizedIP和Input的数据量比例。(如图7)

图7reads在元件中的分布曲线图。绿色表示CDS，蓝色表示UTR，，纵坐标表示normalized后的覆盖深度

特征三、Peak关联基因的特征

针对Peak关联上的基因，看它的stop-coden、start-coden是否有m6A富集区域（peak），以此将gene分为4类：PeakStart(m6Apeaksaroundstartcodon),PeakStop(m6Apeaksaroundstopcodon),PeakBoth(m6Apeaksaroundbothstartandstopcodons)andothers。

图8peak关联基因特征pie图

两样品peakoverlap占50%以上则定义为commonpeak，其他的定义为specialpeak。共有和特有peak的韦恩图如下(见图9)：

图9两样本peak韦恩图

通过以上的m6A特征分析，后续的重要分析还包括针对差异peak来分析关联的基因，以及对这些基因进行GO和KEGG分析。其次，还可以针对目前Zxin的研究热点，对peak进行circRNA分析，有利于指导环状RNA翻译功能的研究工作[1]。

另外，通过和同组样本转录组测序数据的联合分析，可以进一步深挖m6A修饰对可变剪切、RNA编辑、RNA表达丰度、miRNA加工生成等方面的影响；也可以结合蛋白质谱定量检测，研究m6A修饰与蛋白质翻译的关系，指导进一步的深入功能机制研究。

自2011年何川教授发表FTO作为m6A去甲基化酶[8]的研究工作以来，m6A的研究深度和广大快速发展。为了帮助国内生物医学特别是肿瘤领域的科研人员更好的理清m6A的研究思路，表观生物制定以下疾病相关m6A研究策略以供参考。

研究案例：FTO通过RNA修饰机制发挥促癌作用

2017年1月，辛辛那提大学研究人员在CancerCell杂志发表论文[9]，报道了发现肥胖相关蛋白FTO能够通过RNA修饰机制调节一系列基因的表达，发挥重要的促癌作用，导致白血病细胞增多并YZ癌细胞对药物的应答。

研究人员利用100个人类急性髓系白血病（AML）样本以及9个正常对照样本的芯片数据，还对其他一些大规模AML样本数据进行了分析。他们发现FTO在不同亚型的白血病样本中都存在高表达。（见图10）

图.10FTO基因在AML样本中存在高表达

图11.FTO靶向调控ASB2和RARA等YZ白血病细胞生长的基因，通过去甲基化修饰后，反向YZASB2和RARA的功能

实验证明FTO靶向调控ASB2和RARA等YZ白血病细胞生长的基因，通过去甲基化修饰后，导致靶mRNA稳定性提高，也相应提高了蛋白质含量，这个结果与之前认为的m6A导致mRNA稳定性下降的结论出现了相反。另外通过沉默m6A的识别蛋白YTHDF1和YTHDF2，发现只有YTHDF2能影响到ASB2和RARA的mRNA水平，但是对于这两个蛋白的丰度却没有产生作用。提示还有新的调控机制尚待发现。

文章Z后提出了FTO---ABS2/RARA调控轴的机制模型：由于融合基因等因素的影响如MLL-fusion蛋白等刺激导致FTO表达上升，降低靶基因如ASB2，RARA等的mRNAm6A修饰，YZ其功能发挥，促进了细胞增殖和YZ细胞分化，并且YZ癌细胞对药物的应答。

图12.机制模型

这项研究首次证实m6A修饰机制在白血病发育和药物应答过程中有重要作用。靶向FTO信号途径可能成为ZL白血病的一个新的策略。另外FTO也在其他一些实体瘤中发挥促癌作用，因此该研究结果可能对癌症生物学研究和癌症ZL方法的开发有更广泛的影响。

参考文献：

[1]ZhouC,MolinieB,DaneshvarK,etal.Identificationandcharacterizationofm6AcircularRNAepitranscriptomes[J].bioRxiv,2017:115899.

[2]CaoG,LiHB,YinZ,etal.Recentadvancesindynamicm6ARNAmodification[J].Openbiology,2016,6(4):160003.

[3]AlarcónCR,GoodarziH,LeeH,etal.HNRNPA2B1isamediatorofm6A-dependentnuclearRNAprocessingevents[J].Cell,2015,162(6):1299-1308.

[4]LiA,ChenYS,PingXL,etal.Cytoplasmicm6AreaderYTHDF3promotesmRNAtranslation[J].Cellresearch,2017.

[5]YangY,FanX,MaoM,etal.ExtensivetranslationofcircularRNAsdrivenbyN6-methyladenosine[J].Cellresearch,2017.

[6]DominissiniD,Moshitch-MoshkovitzS,SchwartzS,etal.Topologyofthehumanandmousem6ARNAmethylomesrevealedbym6A-seq[J].Nature,2012,485(7397):201-206.

[7]刘恋,张绍武,孟佳,等.高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics,2015,42(10):891-899.

[8]JiaG,FuY,ZhaoX,etal.N6-methyladenosineinnuclearRNAisamajorsubstrateoftheobesity-associatedFTO[J].Naturechemicalbiology,2011,7(12):885-887.

[9]LiZ,WengH,SuR,etal.FTOplaysanoncogenicroleinacutemyeloidleukemiaasaN6-methyladenosineRNAdemethylase[J].CancerCell,2017,31(1):127-141.

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2004-09-02 09:23:08

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