实时荧光定量 PCR 引物设计原则

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【导读】实时荧光定量PCR（real-timePCR）技术和普通PCR相比，准确性和灵敏度高，速度快，效率高，近年来被广泛应用于医学、生物等各个领域，是进行分子生物学研究必不可少的技术工具...

实时荧光定量PCR（real-timePCR）技术和普通PCR相比，准确性和灵敏度高，速度快，效率高，近年来被广泛应用于医学、生物等各个领域，是进行分子生物学研究必不可少的技术工具。在科研方面可定量分析各种基因的的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态SNP测定及易位基因的检测；在YL方面可用于免疫组化分析临床疾病早期诊断，病原体检测，耐药性分析，肿瘤微小残留病变研究，细胞因子的表达分析，病毒感染的定量检测等。

在整个荧光定量PCR实验设计中，引物的设计是实验成功的关键因素，很大程度决定了检测的灵敏度和准确性，一般real-timePCR引物的设计应遵循如下原则：

1.引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。

2.扩增产物长度在80-150bp。Z长不要超过300bp。

3.产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。

4.引物长度：一般在17-25碱基之间，上下游引物不宜相差太大。引物长度是决定退火温度（Tm值）Z重要的因素。一般来讲，每增加一个核苷酸可使引物特异性提高4倍，但是由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

5.引物自身不能有连续4个碱基的互补，避免形成发卡结构。

6.引物之间不能有连续4个碱基的互补，避免形成引物二聚体。

7.引物G+C含量在40%～60%之间，45-55％Z好。引物中碱基要随机分布，尽量均匀，若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5』端加适量的A、T或G、C尾巴来平衡一下。

8.引物Tm值在58-62度之间，上下游引物Tm值不宜相差太大，Z好不要超过5度。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，提高PCR的特异性；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。

9.引物5′端可以修饰；引物5′端一般不会影响扩增的特异性，可进行修饰，如加酶切位点；标记生物素、荧光、、Eu3+等；引入突变位点、插入与缺失突变序列等。

10.引物3′端不可修饰，引物3』端是延伸开始的地方，决定扩增的特异性。3』端应避开连续的T/C,A/G（2-3个）；也不能有形成任何二级结构。

11.引物3′端要避开密码子的第3位。因为密码子的兼并性，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

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2004-09-11 09:23:04

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