HF2LI双通道数字锁相放大器用于受激拉曼散射显微成像

相干拉曼散射显微术(Coherent Raman Scattering Microscopy)是一类植根于拉曼散射的光学显微成像方法，主要包含相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-StokesRaman Scattering, CARS)和受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)两种方法。CARS/SRS 显微术通过探测目标分子特定的振动来提供成像所需的衬度，通过非线性光学过程大大提高了检测的灵敏度，同时本征地具备三维成像能力。CARS 和 SRS 显微术可以对脂类等不易被标记的物质成像，还可以很好地通过选择振动光谱, 对生物体内特定小分子物质如药物等以及生物大分子如核酸、蛋白质等进行无需标记的成像，因此成为极有潜力的活体(in vivo)成像手段。

拉曼散射是发生在光和分子振动能级间的相互作用。在不满足电子能级共振条件的情况下，分子吸收光子的能量不能完成向电子激发态的跃迁，但是可以到达一个中间态，即虚态。处在虚态的分子会迅速向低能态跃迁，同时发射出一个光子，这就是散射过程，发射出的光子就是散射光。如果散射光子和原来的光子频率相同，称之为瑞利散射(Rayleigh Scattering)。如果分子从虚态向下跃迁时，到达比原来能量高的态，散射光的频率将降低，称之为斯托克斯散射(Stokes Scattering)；相反，如果终态的能量比初态低，那么散射光的频率将升高，称之为反斯托克斯散射(anti-Stokes Scattering)。斯托克斯与反斯托克斯散射统称为拉曼散射(Raman Scattering)。显然，拉曼散射是光的非弹性散射。拉曼散射的截面(cross section)很小，因此自发拉曼散射的信号强度通常很低。能量在分子振动能级和光子之间发生交换，其大小对应振动能级间距，散射光的频率移动(拉曼位移)也因此与分子振动的频率相同。斯托克斯线与反斯托克斯线在光谱上则相对于入射光的频率对称分布。

受激拉曼散射显微镜的工作原理

自发拉曼散射是分子对光子的一种非弹性散射现象，在这个现象中，散射光子的频率较入射光子相比发生了改变，改变量对应分子内部振动模式的频率，这个现象在1928年由印度物理学家Raman C V发现的。激光出现后，在激光器的激发下，使某些介质的散射过程具有受激性质，这就是受激拉曼散射（SRS）。
如下图所示，采用两束满足共振条件的激光，即泵浦光和斯托克斯光进行激发，SRS过程可在生物组织样品中发生。当泵浦光和斯托克斯光的频率差，与特定分子化学键的振动频率（Ωvib）相等而发生共振耦合时，分子就会从基态跃迁到它的振动激发态。光和分子之间发生能量交换，一个泵浦光子借助分子振动能级的跃迁而转化为了斯托克斯光子。泵浦光发生了受激拉曼损失（stimulated Raman loss, SRL），导致强度降低，同时斯托克斯光发生了受激拉曼增益（stimulated Raman gain, SRG），强度升高。通过一定的技术手段来检测SRL或SRG，即可作为成像的衬度来源。

对泵浦光和探测光都进行电光调制或者声光调制，可以在同一个受激拉曼散射实验装置中，实现相干拉曼散射成像（CARS）和受激拉曼散射成像（SRS）以及通过微弱的调整可实现的双光子吸收光谱（TPA）。如下图则是采用双调制获得拉曼成像的实验装置及成像结果[1]。

[1] Jessica C. Mansfield, George R. Littlejohn, Julian Moger, etc. Label-free Chemically Specific Imaging in Planta with Stimulated Raman Scattering Microscopy, Anal. Chem. 2013, 85: 5055-5063