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重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白（rIFNα2b-HSA），是由人干扰素α2b和人血清白蛋白2种编码基因通过基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌，通过诱导表达产生的胞外分泌蛋白。干扰素类重组蛋白药品是目前临床上广泛用于治 疗乙型肝炎、丙型肝炎等顽症的有效药物。2015年版《中华人民共和国药典》对重组蛋白制品的纯度要求为不低于95.0%。

本次分享的应用中，作者采用离子交换色谱柱TSKgel Q-STAT建立了测定重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白药物纯度的方法，经验证该方法适合rIFNα2b-HSA纯度检测。

溶液配制

供试品溶液：采用水稀释供试品成质量浓度为1 mg/mL的溶液。

专属性验证样品溶液：取供试品0.5 mL，加入0.8 mol/L氢氧化钠溶液30 μL，置于摇床上，200 r/min摇动10min，用5%磷酸溶液中和，用水稀释2倍，按上述方法进样。

分析条件

色谱柱：TSKgel Q-STAT（4.6 mmI.D.×10 cm）

流动相A：20 mM Tris-HCl (pH 8.5)

流动相B：20 mM Tris-HC+0.5 M NaCl (pH 8.5)

梯度洗脱：0～3 min, 100%A; 3～18 min, 100%A-0%A; 18～21 min, 0%A; 21～22 min, 0%A-100%A

流速：0.5 mL/min

进样体积：20 μL

柱温：25℃

检测器参数：UV@214 nm&280 nm

分析结果

图1 离子交换色谱法系统适用性试验结果

（蓝色为214 nm；棕色为280 nm）

图2 例子交换色谱法专属性试验结果

（蓝色为214 nm；棕色为280 nm）

图3  浓度与峰面积线性关系图

表1 三种纯度测定方法检测结果的比较（%）

结果与讨论

采用TSKgel Q-STAT色谱柱建立的重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白纯度测定方法 (见图1)，主成分峰在 214 nm 处响应值较280 nm 处更好，故采用 214 nm 作为该方法的检测波长。供试品经碱破坏后，其降解产物色谱峰与主成分峰能有效分离 (见图2)，表明方法专属性良好。

线性考察结果见图3，在浓度范围0.05~1.0 mg/mL范围内，样品浓度与峰面积，线性关系良好 (R2=0.9974)；精密度测试结果，RSD为0.52% (n=6)；定量检测限为0.0018 mg/mL (S/N=10)；与反相色谱法、电泳法的对比检测结果见表1，纯度结果均大于95%。

以上结果均符合 2015 年版《中华人民共和国药典》对实验方法的验证要求 ，可以作为重组人血清白蛋白与干扰素α2b融合蛋白的纯度检测方法之一。

参考资料：

1. 杜莹莹, 武福军, 韩浩, 张亚男, 刘志向敏 离子交换色谱法测定重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白纯度. 药物分析杂志. 2020,40(8)：1490-1493