假阳性的预防及处理,每一位PCR实验人员都绕不开的必修课
PCR技术因其快速、灵敏、特异等特性广泛应用于分子生物学的研究与检测中,但却对实验环境及操作有着严格的要求,稍有不当则会导致假阳性产生。污染严重时甚至可以持续数月,很难在短时间内控制。换引物、换试剂、换耗材、换实验楼,甚至有人跑到两公里外的实验室加样也无济于事,如何避免及处理假阳性问题已经成为每一位PCR实验人员的必修课。
01 什么是PCR假阳性
假阳性结果示例1(Q1600荧光检测)
PCR假阳性包括两种,即检测阴性材料得到阳性结果,检测空白对照(加入去离子水)出现阳性结果,实验中设立的阴性对照可以提示有无假阳性结果出现。
假阳性结果示例2(Repure-A电泳检测)
02 PCR假阳性的原因有哪些
PCR扩增产物污染是导致假阳性的重要因素,因其拷贝量大,微量的污染源即可导致阳性结果,其中以气溶胶污染Z为常见。其次,PCR试剂及样本的交叉污染也会导致假阳性。PCR试剂的污染包括加样枪、容器、双蒸水及其它溶液的核酸污染,样本污染主要是取样工具之间的交叉污染或加样污染。
此外,在实验室操作中经常会用到阳性参考品,参考品大多数由某些克隆质粒制作而成,克隆质粒使用不当也会造成污染。
03 假阳性的预防及解决措施
①规范实验室设计:实验室包括配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区,在连续独立的空间完成不同实验操作。若没有专业的实验室,至少需要保证配液、加样与检测在不同的区域;
②规范实验室操作:实验室定期通风与消毒,仪器定期清洁,并使用气溶胶清除剂。使用一次性用具,小心操作,避免交叉污染;
③规范试剂耗材管理:新买试剂需进行实验前验证并进行分装,所用耗材需高压消毒;
④实验前预防:首先需保证所设计引物的特异性,防止引物自扩增,其次还可使用UNG酶及dUTP防污染体系;
⑤污染后处理:如遇污染应立即停止实验,采取开窗通风,紫外灯照射,喷雾装置喷洒等操作,此后若连续三天阴性对照正常即可恢复正常实验。
04 二维梯度PCR可有效避免多次PCR带来的假阳性风险
DY轮PCR的污染基本可以避免,PCR实验越频繁,则越容易污染,能一次做50个,不要分开5次每次做10个。而对于科研实验而言,使用二维梯度PCR可以一次得到96个温度组合,而不需要分开8次,每次做12个梯度,在节省人力物力的同时也大大降低了假阳性的风险。
RePure-D 二维复合梯度基因扩增仪
RePure-C 二维梯度基因扩增仪
“上YZ未病”,对于PCR的初学者而言,做实验之前首先需要树立“预防”的观念,严格把控样本处理、核酸提取、扩增及检测的每一过程。同时,在实际操作中也需要注意规范实验步骤,避免因加样失误而导致的交叉污染,从源头杜绝假阳性现象。
相关产品
全部评论(0条)
推荐阅读
-
- 在手套箱中进行锂电实验时,如何保证实验人员的安全
- 在当今科技飞速发展的时代,锂电池作为一种重要的能源存储设备,被广泛应用于各个领域。为了更好地研究和开发锂电池,许多科研人员和工程师会在手套箱中进行锂电实验。
-
- 生物安全柜的紫外灯对实验人员有什么危害?如何正确使用紫外灯?
- 生物安全柜的紫外灯对实验人员有什么危害?如何正确使用紫外灯?
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:仪器网"的所有作品,版权均属于仪器网,转载时须经本网同意,并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi
参与评论
登录后参与评论