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结核病是经呼吸道传播，由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的传染病。目前临床结核病诊断的金标准是痰液结核分枝杆菌培养[1]，但该方法检测周期长、阳性检出率低，诊断性能欠佳。聚合酶链反应（PCR） [2-4] 和酶联免疫[5-6]法稳定性差，假阳性率高。因此亟待开发一种简单、准确、便捷、敏感度高的检测手段，弥补现有技术的不足，实现结核病的早期预诊。 

结核分枝杆菌分泌的 10 KDa 培养滤液蛋白（CFP-10）是一种低相对分子质量蛋白质，且为结核分枝杆菌在内的少数致病性分枝杆菌所特有，因此可考虑 CFP-10 作为结核病早期诊断的生物标志物[7]。目前血液中结核分枝杆菌分泌的 CFP-10 检测采用 NanoDisk-MS 技术，该技术将抗体标记的纳米盘与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）相结合，具有较高的敏感性和特异性，但纳米盘材料为实验室自制材料，限制了其在临床上的应用，且该方法仅能实现半定量[8]。因此，迫切需要开发新的血清中CFP-10 的质谱检测方法。三重四极杆液质联用仪多反应监测(MRM)技术，通过对靶标蛋白酶解产生的特异性肽段进行质谱监测[9]，具有灵敏度高、分析速度快、选择性强等优点，被视为靶向蛋白绝对定量的重要手段，并已应用于特异性生物标志物的筛选验证[10-12]。 

1.1 标准溶液配制 

称取 CFP-10 抗原适量，加 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸），配制成质量浓度 1.0 mg/mL 的溶液作为贮备液，-20 ℃保存。再用空白血清稀释贮备液，制成质量浓度分别为 1.0，3.0，5.0，10，25，50，100 ng/mL的系列标准工作溶液。 

1.2 样品前处理 

取 400 μL 人血清，加入 0.4 mL 乙腈，涡旋 1 min，于 12000 r/min 离心10 min 后，取上清液离心浓缩至干，依次加入 0.4 mL NH4HCO3 溶液（50 mmol/L）、胰蛋白酶溶液，混匀，于 60 ℃孵育 4 h 后取出，加入 1.6 mL 8%(V/V)H3PO4终止反应，待固相萃取柱上样。 

固相萃取：用 3 mL 甲醇活化，3 mL 水平衡强阴离子交换小柱后上样，依次用 1 mL 5%(V/V)氨水、1 mL 5%(V/V)乙腈、1 mL 1%(V/V)甲酸水溶液清洗，用 1 mL 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸）洗脱，收集洗脱液，离心浓缩至干，复溶于 100 μL 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸），于 10000 r/min 离心10 min 后取上清液，待 UPLC-MS/MS分析。 

1.3 测定条件 

色谱柱：Phenomenx Luna Omega PS-C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）；柱温：60 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；流动相 A：0.1%甲酸水溶液（含 100 μmol/L NH4F），流动相B：乙腈；梯度洗脱：0 ~ 1 min， 5% B; 1 ~ 3 min，5%~20% B; 3 ~ 6.5 min，20%~25% B; 6.5 ~ 7.5 min，25%~95% B; 7.5 ~ 8 min，95%~5% B; 8 ~ 10 min，5% B。 

电喷雾离子源，正离子模式（ESI+）；离子源温度：150 ℃，毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂气温度：500 ℃；流速：1000 L/h；锥孔气流速：150 L/h；雾化器压力：7.0 bar。监测模式：多反应监测（MRM）。CFP-10特异性肽段 TDAATLAQEAGNFER 的质谱检测参数：母离子 m/z 797.5；子离子：m/z 1021.5，822.5，定量离子为 m/z 1021.5；锥孔电压：60，60 V；碰撞能量：30，25 eV。 

2.1 色谱-质谱条件优化 

在 ESI+模式下，对 CFP-10 特异性肽段的离子源参数和碰撞能量等进行优化，确定质谱信号较高的参数。首先对 CFP-10 特异性肽段（m/z 1593.75）进行全扫描分析，检测到[M+2H]2+（m/z 797.5）质谱峰作为母离子，优化碰撞能量、锥孔电压等参数，确定了定量和定性离子。CFP-10 特异性肽段的二级质谱图见图 1。 

图1 CFP-10特异性肽段的子离子扫描质谱图

实验选择 Phenomenx Luna Omega PS-C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）色谱柱，以甲酸水溶液-乙腈流动相体系进行梯度分离，比较了不同体积分数甲酸水溶液（0%，0.1%，0.2%，0.3%）-乙腈流动相体系，发现在水溶液中添加 0.1%甲酸时，CFP-10 特异性肽段的质谱响应最高。为进一步降低背景干扰，提高电离效率，在 0.1%甲酸水溶液中添加 50，100，200，500 μmol/L NH4F，发现 CFP-10 特异性肽段的质谱响应均有所提高，且在添加 100 μmol/L NH4F 时质谱响应最强，这可能是由于在 ESI+模式下，游离氟离子与Na+形成 NaF，减少了[M+Na]+的生成，从而提高了电离效率。实验最终确定流动相体系为乙腈-0.1%甲酸水溶液（含 100 μmol/L NH4F）。对柱温、流速等条件进行了优化，结果见 1.4 节色谱条件。 

2.2 前处理条件优化 

本实验首先采用蛋白沉淀法对血清样品进行预处理，并对不同沉淀剂（甲醇、乙腈）的沉淀效果进行比较，结果发现乙腈沉淀效果更好。继而对血清与乙腈的体积比（0.8:1，1:1，1.2:1，1.4:1）进行优化，发现当血清与乙腈体积比为 1:1 时，酶解效率最高。本实验通过蛋白质沉淀除去部分高丰度蛋白后，对血清样品进行酶解，并对酶活性进行优化。选择不同活性的 3 种胰蛋白酶（a，b，c）考察酶解效率，结果表明活性最高的胰蛋白酶 c 酶解效率最高，但其价格较胰蛋白酶 b 高出1500 倍，而其酶解效率仅为胰蛋白酶 b的 1.5 倍。考虑到经济效益，本实验优选中等酶活性的胰蛋白酶 b。实验还对酶用量、酶解时间和温度进行了优化，结果见 1.3 节，当 CFP-10 抗原与胰蛋白酶 b 的质量比为 5 时，于 60 ℃下酶解 4 h，可获得最高的酶解效率。采用 10%(V/V)乙腈（含1%甲酸）作为洗脱剂时洗脱效率最高，收集的洗脱液采用 20%(V/V)乙腈（含 1%甲酸）作为复溶溶剂时峰面积最高，但峰形差，溶剂效应强。综合考虑，选择 10%(V/V)乙腈（含 1%甲酸）作为复溶溶剂。 

图2 (a) 空白血清、(b) 实际结核病人血清样本和(c)空白血清+CFP-10 的色谱图 

2.3.2 线性范围、检出限和定量限  将 CFP-10 标准溶液加入空白血清样品中，配制不同浓度（1.0，3.0， 5.0，10，25，50，100 ng/mL）的标准溶液，按 1.3 节方法处理后上机测定。以 CFP-10 浓度（x，ng/mL）为横坐标，以 CFP-10 特异性肽段峰面积（y ）为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=39.5355x–15.8826，相关系数 r2=0.9906，表明 CFP-10 在 3~100 ng/mL 范围内呈良好的线性关系。以 3倍信噪比（S/N）对应的 CFP-10 的质量浓度作为方法的检出限（LOD），10 倍 S/N 对应的 CFP-10 的质量浓度作为方法的定量限（LOQ），因此本方法的 LOD 和 LOQ 分别为 1.0 和 3.0 ng/mL。 

2.3.3 加标回收率及精密度  取空白血清，分别配制低、中、高（10，25，100 ng/mL）3 个浓度水平的质控样品，各浓度平行制备 3 份，按 1.3 节方法处理后上机测定。连续 3 日重复加标回收率实验，对日间精密度进行考察。如表 1 所示，CFP-10 在低、中、高 3 个添加水平下的回收率为 89.8%~108.1%，且日内和日间结果的相对标准偏差（RSD）均低于 10%，表明方法具有良好的准确度和精密度，满足生物样本分析要求。 

表1 血清中CFP-10的平均回收率和相对标准偏差 (n=3)

2. 3. 4 稳定性  取低、中、高 3 个浓度水平的质控样品，按 1.3 节方法处理后置于自动进样盘（10 ℃）中，分别于 0，2，4，8，12，24 h 进样测定。结果表明，测得 CFP-10 含量结果的 RSD 为 2.5%~5.7%，日内稳定性良好。取低、中、高 3 个浓度水平的质控样品，按 1.3 节方法处理后于-20 ℃冷冻保存，分别于 1，3， 5，7 d 解冻后测定，测得 CFP-10 含量结果的 RSD 为 5.0%~9.8%，表明样品在-20 ℃贮存 7 d 稳定。 

2.3.5 与其他方法比较 将本方法与文献报道的抗酸染色涂片法（AAS）、分枝杆菌培养法、基于PCR 的Xpert MTB/RIF、基于 ELISA 的结核 γ-干扰素释放法（IGRA）进行比较，结果见表 2。本方法敏感性高于 AAS法和分枝杆菌培养法，操作时间短，8 h 内便可获取结果；采用血清样本，易于获取，对于结核症状改善后痰液难获取的情况[8]，可作为经典方法的有力补充。  

表2 本方法与其他报道的检测方法比较 

AAS: antiacid stains smear; IGRA: interferon γ release assay；Sensitivity = number of true positives / (number of true positives + number of false negatives) × 100%；Specificity = number of true negatives / (number of true negatives + number of false positives) × 100%.

图3 结核病和非结核病例中CFP-10 的浓度