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- hbbdlhb220 2014-04-01 00:00:00
- 如何科学有效地记录实验数据 在实验学科中，数据起着至关重要的作用，获得科学有效的数据是每个实验者所应具有的素质。在我们实验室近十年工作经验的基础上，结合其他实验室的经验，主要对旋光、核磁及对映体过量（ee值）等数据测定中应注意的事项加以列举。原则是：尽量diyi时间收集齐必要数据，否则以后补充数据会花费许多不必要的时间和精力，如果是已知物要和文献数据加以对照。对未知化合物应该收集核磁共振氢谱和碳谱、高分辨质谱或者元素分析、熔点（如果是固体）、旋光（如果是手性化合物）和红外光谱等；对已知化合物应该收集核磁共振氢谱、熔点（如果是固体）和旋光（如果是手性化合物）等。在测试结束后，应及时、准确地将数据记录在实验记录本上（不要先抄写在一张小纸条上，然后再抄到实验记录本上，步骤越多，出错的可能性越大），以备查阅、撰写论文和在以后的研究工作中作为参考。 diyi部分：测定旋光注意事项 1. 得到产品后，要尽快测定其旋光（这里的旋光为比旋光度），不宜长时间放置后再测定。因为长时间放置可能会导致产品变质，再次测量时瓶子的质量也可能因为天平没有校正而发生变化，从而导致旋光值不准确。 2. 测定旋光前，如果是已知物要查明文献中报道的旋光值，Z好多查几篇文献，因为许多文献的数值不一致，尽量选择权威论文的数据，包括浓度、温度、溶剂及旋光值。测定产品的旋光时，可以与文献值比较，做到心中有数。 3. 待测的产品在测量前一定要抽干，以保证称量质量的准确。 4. 配制待测产品溶液所用的溶剂Z好用新开封的。因为已开封的溶剂在使用时可能被污染，会有杂质，造成测定数据不准确。 5. 配制的待测产品溶液的浓度要适中，不宜太高，也不宜太低，一般浓度为0.2-1.0（10 mg/mL-100 mg/mL）左右为好。 6. 配制的待测溶液时，产品在其中要全部溶解。若溶解后为浑浊液，应考虑使用溶解度更好的溶剂；若溶解后有小颗粒，证明产品中有杂质，必须先将产品进行处理，除去不溶性的杂质，再进行测定。 7. 测定旋光前Z好用一个已知旋光值的物质作为标准，对所用旋光仪进行校准，以保证旋光仪测量数据的准确。 8. 开启旋光仪后需等一段时间再进行测量。因为旋光仪所用钠光灯的正常起辉时间至少20 分钟，之后发光才能稳定，这时测定才会比较准确。 9. 测定管光面两端的玻璃，在测量时不要用手触摸，以免玻璃被污染，影响光路，使测量不准确。如果不干净，用软布或专门的擦拭纸擦净，不要使用普通的纸，以免损伤玻璃面，影响光路。 10. 将装有待测溶液的测定管放入样品室之前，一定要确保光路中没有气泡，否则会对样品的旋光值有较大的影响。 11. 测定时应尽量固定测定管放置的位置和方向，做好标记，以减少测定管及盖玻片应力的误差，使测量数据更准确。 12. 测定旋光时一定要及时记录测定时的温度。因为温度对物质的旋光有一定影响，不同的温度下测定的旋光值可能有所差别。 13. 测定旋光时一定要及时记录所用的溶剂。因为在不同溶剂中，由于缔合、溶剂化和解离等情况的不同，会使比旋度产生变化，甚至改变旋光方向。具有1，3-丙二醇结构的氯霉素Chloramphenical，只有(1R，2R)-(-)-异构体才显示KJ活性，其在无水乙醇中呈右旋性，比旋光度+18.5~+21.5，而在乙酸乙酯中呈左旋性，比旋光度为-25.5。 14. 测定结束后，将测定管洗净晾干放回原处。数据要立即写在记录本上，Z好将文献中的旋光数据也写在记录本上，与所得数据加以对照。 第二部分：核磁测试注意事项 1. 得到产品后，核磁共振要立即测，不宜长时间放置后再去测，因为长时间放置可能导致产品变质。其中一种极端情况是：长时间放置后产物会发生异构化，如反式异构体变为顺式异构体，或者发生重排反应等，从而导致测定的核磁共振数据不准确。 2. 实验室测试所用核磁管一般内径为5 mm，(微量样品用3 mm的样品管)氘代试剂溶解后的样品体积在核磁管中高度约3.5 cm，体积约0.5 mL，溶剂量太少会影响匀场，溶剂量过多则造成浪费。 3. 氢谱测试所需样品量较少，约3-7 mg，碳谱测试所需样品量较多，一般需要多于20 mg，测试氢谱时浓度太低则噪音较大、基线不平；浓度太高则谱峰裂分不好，请适当掌握；测试13C时浓度高可缩短测试时间，噪音小，基线平直，谱图漂亮。若1H、13C谱同时做，要保证管装样品量大于20 mg。 4. 为保证谱图质量，核磁管必须清洗干净，样品的纯度越高越好，其中残余溶剂必须除净，否则严重影响谱图的解析。样品在氘代试剂中溶解度要好（送样人要提前选好合适溶剂），溶解后溶液均匀透明，若有固体微粒必须首先过滤，否则仪器不能测试，并且样品中不得含顺磁性物质。 5. 核磁管要及时清洗，先加入对样品溶解性Z好的溶剂冲洗，一般使用丙酮，清洗2-3次后，使用核磁管刷（末端绑上棉花）清洗，再用丙酮清洗干净。核磁管在干燥箱中Z好不要平放，一定要多支捆绑在一起立着放，这样能保证核磁管在高温下不变形。 6. 有些样品在常温下两个构象异构体转化的能垒较高，不能迅速达到平衡，这时核磁共振谱图上会出现一些宽峰，甚至消失或不出现。这时如果把做核磁共振的温度提高，两种构象异构体异构体能迅速达到平衡（具体的例子，可参考：J. Org. Chem. 2005， 70， 1679），这样就能得到正常的核磁共振谱图。 第三部分：对映体过量（ee值）测试注意事项 GX液相色谱测对映体过量（ee值）时，需要的样品量不多，但是需要消旋的样品作为对照，否则无法区分杂质与样品的峰值（尤其是ee值高时）。同时也要注意以下几个方面： 1. 需要的样品量在色谱图上浓度在80-200 mAU之间为好，太少噪音峰容易造成干扰，太多可能会在柱上残留，信号峰强度Z好不要超过500 mAU， 以防堵塞色谱柱。测试前可以在硅胶板上用毛细管点样用紫外灯显色后根据经验观察浓度是否合适。 2. 样品纯度要高，否则杂质可能会与目标峰完全重合或是部分重合，从而造成测定数据不准确，不能得到漂亮的色谱图；另外，若是样品中含有较多的杂质，特别是粉末状杂质，则会堵塞手性柱。因此，在配制样品时，应使样品完全溶解，或使用过滤器过滤得到澄清溶液。 3. 配置前样品中的残余溶剂要除净，防止因溶剂峰过高而不能得到漂亮的色谱图。溶解样品的溶剂Z好选择和流动相相同的溶剂，或者是流动相中的溶解性较好的那种溶剂。 4. 配置样品时，要将样品完全溶解后，取一到两滴转移到专用的液相测量瓶中，再加入溶剂稀释到合适的浓度。对固体样品，一定要将样品完全溶解后配制，因为在固体样品中，各部分ee值可能不同（如外消旋化合物，一部分可能为 ee，另外一部分可能为0% ee），这样可能造成数据重复性很差。所以对于固体样品，一定要将样品全部溶解后取适量于样品瓶中，再稀释到需要浓度。 5. 样品一般需要现场配制，长时间放置后容易变质。 6. 使用手性柱测定HPLC数据时，要注意柱压不要超过50 bar。如使用异丙醇/正己烷作为流动相时，溶剂体积比为90/10时，流速一般不超过1.0 mL/min， 为80/20时，流速一般不超过0.8 mL/min， 选择更大极性的流动性时，流速相应也要降低，以使柱压不超过50 bar. 7. 测定样品时，要注意流动相的体积变化，当少于总体积的20%时，应及时添加流动相，以防止体系中进入气体。 8. 测定后的数据要及时记录在实验记录本和专用的HPLC数据记录本上。 以上为根据经验所总结的测定旋光、核磁和ee值中所需要注意的事项，要获得科学的实验数据请参照上述经验进行操作。原则是：尽量diyi时间收集齐所有的必要数据。对未知化合物应该收集核磁共振氢和碳谱、高分辨质谱或者元素分析、熔点（如果有）、旋光（如果有）和红外光谱等；对已知化合物应该收集核磁共振氢和碳谱、熔点和旋光（如果有）等。若有不足或不当之处，请指正。
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- 如何更好地记录实验数据
- 如何更好地保养环氧乙烷灭菌设备？
对于消毒灭菌设备的使用注意事项，这对大家来说一直是日常比较关注的，那么，保养和存放的方式呢？大家有认真地了解和注意吗？
日常保养和存放消毒灭菌设备的相关措施：
①堆放灭菌物品时，应确保留出足够的空隙，不能堵塞安全阀、放汽阀的出气孔，以确保空气的顺畅，确保安全。
②应将液体灌装在耐热玻璃瓶中进行灭菌，液体不应超过瓶体积3/4，瓶口不宜使用打孔的橡胶或软木塞，而应用棉花纱塞。
③定期检查安全阀，当安全阀不合格时应立即更换。
④灭菌结束后，不能立即释放蒸汽，必须待压力表指针回零后方可排放余气。
⑤不要将不同类型、不同灭菌要求的物品放在一起进行灭菌。
⑥与蒸汽介质接触引起爆炸或突然升压性的化学物品，不能用灭菌器进行灭菌。
⑦压力表应定期进行校验，必要时及时进行更换。
⑧经常检查密封圈密封性，并及时更换。
⑨消毒灭菌设备使用后，应将容器内的水清除，容器或电热管上如有水垢也应进行清理，以延长寿命。
医用灭菌器是于YL设备消毒灭菌的一种设备。该设备能彻底杀灭微生物体细菌、病毒等，具有消毒成本低，安全可靠及对器械损伤小等特点，通过全自动微电脑检测使得操作简单，灭菌过程自动化和标准化，灭菌结束自动打印结果，灭菌后的器械无任何化学残留物，不需另行冲洗，减少派护人员劳动量，全过程密闭式灭菌，废液无移无害，不污染空气和环境。确保医护人员的健康。
医用灭菌器其优越的灭菌性能，临床应用于各种腔镜，内窥镜、手术器械、齿科器械及其他医用器械的一次性循环消毒灭菌。在医院规模不断扩大、医用灭菌器的使用频率不断增多的情况下，预防性的维修保养对保证设备持续正常使用至关重要，必须高度重视，提高设备使用寿命。
- 如何更好地合成多糖蛋白结合疫苗？
多糖-蛋白结合疫苗
结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖--蛋白结合疫苗。因仅靠多糖抗原不足以提供可靠的保护，多糖仅可诱导B细胞免疫，产生的抗体活性弱，且无法形成免疫记忆，多糖疫苗对婴幼儿无免疫效果。而多糖结合载体蛋白，免疫反应性质发生转变，可以增强免疫原性。如 B型嗜血杆菌（Hib）结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等，可有效诱导婴幼儿免疫。那么，为什么多糖与载体蛋白一定要共价结合吗，如果是松散结合，位于同一滤泡树突状细胞（FDC）中，难道就不能诱导滤泡辅助T细胞（Tfh）反应吗？
答案是不能。原因为当多糖与载体蛋白松散结合时，在FDC提呈过程中，蛋白质和多糖无法同时被多糖特异性B细胞（BCR）结合，导致蛋白质留存在FDC中，多糖被B细胞内化，同样无法被主要组织相容性复合物（MHC II）提呈于B细胞表面，多糖抗原依旧停留在B细胞内化阶段。
图源：《Understanding Modern Vaccines:Perspectives in Vaccinology》
更好地实现共价结合
多糖-蛋白质共价结合物的形成是基于蛋白质分子中的氨基酸侧链的自由氨基和多糖分子还原末端的羟基之间的羟氨反应，即Maillard反应。蛋白质分子在水溶液中趋于形成各种高级结构，一些反应基团被包埋于结果内部。而多糖由于立体效应，具体强烈的取向性。因此，蛋白质和多糖的反应条件较为严苛。
反应必须在低于蛋白质变性的温度条件下进行的，而且反应时还需控制反应体系中的较低水分活度使得蛋白质中的氨基处于非聚集的反应状态。此条件下，Maillard反应速度很慢，通常需要2-3天，甚至更长。
通常操作步骤：
多糖预处理：降低分子量，降低粘度
将多糖溶解在选定的pH缓冲溶液中
搅拌均匀后进行冷冻干燥
加入蛋白质，在合适的温度（如37°C）进行长时间反应
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有没有这样一款设备，既能在反应过程中监控粘度的变化，又能测pH，还能实现温控和长时间的搅拌呢?!
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IKA EasySyn 化学合成釜化学合成釜搭配 Starvisc 搅拌扭矩测量仪，实时显示扭矩（对应粘度），用扭矩值精确控制，消除批次间的差异
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7口釜盖可同时集成：搅拌，温度和pH。搅拌桨，温度和pH均为PTFE材质，耐化学腐蚀。
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操作安全：温控管固定在支架上，由排气排液阀再外接控温，减少对夹套接头的应力。玻璃釜体和搅拌头调节下降终点有限位，即便调节高度时没拿稳，釜体也不会碰到桌面，使用更安心。
当然，为避免操作过程中带来不必要的污染，加料可以通过蠕动泵来实现，直接连接到釜盖上即可。我们还可以通过软件实现条件式控制，譬如温度和pH达到预设值后，启动蠕动泵加料，启动搅拌等。实验方法和数据都可以完整记录，分3级管理，完全符合国家食药局的“药品记录和数据管理要求”。
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一、光纤记录工作原理
人类的大脑拥有约900亿个神经元，神经元之间通过突触相互连接形成了复杂的神经网络，并由此产生各种复杂的功能。大脑能够合成和释放上百种神经递质，神经信号通过突触释放的神经递质从而在神经元之间进行传递（图1）。
图1
当神经兴奋传导到突触末端时，会刺激突触上钙离子通道打开促使钙离子大量内流，胞内钙离子浓度瞬时上升，驱动突触小泡将神经递质释放到突触间隙中，释放出的神经递质随即与突触后膜上的受体结合，将递质信号传递给下一个神经元，从而进行信息的逐级传递（图2）。这些神经元以复杂的通路投射到多个脑区，产生了学习认知、情感、控制、动机、奖励等丰富的功能。光纤记录系统则可以通过检测钙离子和神经递质的荧光变化程度来表征群体神经元的活动情况。
图2
那么光纤记录是如何检测神经活动的呢？
以钙离子荧光信号检测为例，光纤记录系统的技术原理是借助钙离子浓度变化与神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针，将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度表现出来，并被光纤记录系统捕捉，从而达到检测神经元活动的目的。
在神经系统中，静息状态时神经元胞内钙离子浓度为50-100nM，而在神经元兴奋时胞内钙离子浓度能上升10-100倍，因此我们可以通过注射钙离子基因编码指示剂（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）来标记钙离子。钙离子指示剂带有荧光蛋白（如GFP、RFP等）及其变异体的蛋白质，可与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域结合（图3左）。当神经活动增强时钙离子通道打开，大量钙离子内流并与CaM结合，导致M13和CaM结构域相互作用，引发cpEGFP结构重排，从而增强绿色荧光信号（图3 右）。
因此我们可以通过检测钙信号的变化来表征神经元的活动，进而研究神经元活动与动物行为的相关性，探究复杂行为背后的调控机制。
图3
(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)
图4：VTA-VGluT2神经元编码先天逃避反应
光纤记录检测神经递质信号的原理与上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神经递质受体，受体与神经递质结合后会引发受体构象改变并发出荧光信号（图5）。通过病毒注射、转染等技术手段，可以将这种可遗传编码的探针表达在细胞或小鼠脑部，借助成像技术，观察神经递质浓度的实时变化。
图5
(Yulong Li, et al. Cell, 2018)
图6：条件反射实验中伏隔核Nac脑区的DA释放
二、光纤记录实验方法
在光纤记录实验中，首先要选择合适的荧光病毒。荧光染料或指示剂是通过病毒载体转入目标脑区，常用载体为AAV病毒。根据实验的不同，需要选择特异启动子或者Cre-FloxP系统来特异标记目标神经元，无特异性的GCaMPs表达虽然可以观测群体神经元活动但无神经元特异性，光纤记录的作用在于观测特异类型神经元群体的活动。
实验流程：
1、在目标脑区注射钙荧光病毒，并在注射位点埋植光纤插针，用于收集荧光；
图7：病毒注射与陶瓷插针埋植
2、待2-3周钙荧光病毒表达后，连接光纤，使用光纤记录系统采集动物在行为学实验中大脑的钙荧光信号；
图8：病毒表达
3、通过分析软件处理钙荧光信号数据，并结合行为学视频对动物的行为进行分析。
图9：光纤记录结合高架十字迷宫实验
三、光纤记录数据分析
以瑞沃德R820三色光纤记录系统记录的数据为例。
1、数据预处理。R820三色光纤记录系统软件集信号采集与数据分析于一体，在数据分析中，数据预处理过程包含平滑处理，基线矫正，运动矫正等功能。
平滑处理可以将数据中的过多杂信号去除，最大限度的突出目标peak。基线矫正多数针对的是荧光信号因长时间记录导致漂白信号逐步下降，或者光纤的自发荧光在长期记录下逐步被漂白基线逐步下降等情况。此情形的数据因为整体呈现下降趋势，不利于后续数据作图分析，所以需要进行基线矫正。运动矫正用于采用410nm对照通道的数据，410nm数据可以用于反应背景噪音信号，运动矫正即将410nm数据与470nm数据进行拟合，通过算法从470数据中去除410nm数据的波动，得到真实的荧光数据。
图10：光纤记录数据预处理
2. 将荧光数据与动物行为数据同步对比，选择事件标记或者增加事件标记，事件相关信号分析作图。
图11：事件分析
3. 将不同组的数据进行组间对比，即可分析不同处理因素下荧光数据的差异。此外，还可结合行为学视频同步分析动物的运动轨迹。
图12：不同数据组间分析
通过以上步骤，原始的荧光数据就可以直接出图啦。
光纤记录实验的工作原理，实验方法以及数据分析已经全部讲完啦….
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