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- 发给e5r5r 2016-12-18 00:00:00
- 细胞培养物污染往往是细胞培养实验室Z常遇到的问题，有时会带来十分严重的后果.细胞培养污染物主要分为两类，一类是化学污染物，例如：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂，另一类是生物污染物，例如：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染.尽管无法彻底消除污染，但是可以通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术，降低污染发生的频率和严重程度. 细菌是一大类广泛存在的单细胞微生物.细菌直径一般为几个微米，外形多样，例如：球状、杆状和螺旋状.细菌由于分布广泛、生长迅速以及体积大小的特点，与酵母和霉菌一起构成了细胞培养中Z常遇到的生污染物.培养物被细菌污染后，几天内即可通过简单的肉眼观察发现；被感染的培养物通常呈云雾状 (即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层薄膜.另外，经常还会发现培养基的 pH 值突然降低.在低倍显微镜下可见，细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的形状. 酵母是真菌界的一种单细胞真核微生物，大小从数微米 (多见) 到 40 微米 (罕见) 不等.与细菌污染类似，培养物被酵母污染后也会变得浑浊，特别是进入污染后期时.培养物被酵母污染后 pH 值变化极小，污染严重时 pH 值才会升高.在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出较小的颗粒.霉菌是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长.这些多细胞丝状体构成的交联网络含有遗传性相同的细胞核，被称为集落或者菌丝体.与酵母污染类似，霉菌污染初期培养物 pH 值会维持稳定，污染加重后 pH 值会迅速升高，导致培养物浑浊.在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块.许多种霉菌的孢子在休眠期均可耐受极端严峻、不利的环境，当其遇到合适的生长条件时才会被活化. 病毒是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制.病毒体积极小，因而要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都十分困难.由于大多数病毒对宿主有非常严格的要求，因此一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响.但是，使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时.通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色、ELISA 实验或者采用适当病毒引物的 PCR 技术可以检测出细胞培养物的病毒污染. 支原体是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够自我复制的Z小的生物.由于体积极小 (般小于 1 微米)，支原体的检测十分困难，除非其达到极高的密度，导致细胞培养物变质，在此之前往往没有明显的感染征象.有些生长缓慢的支原体可能会在培养物中持续存在，而不会导致细胞死亡，但是这些支原体会改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢.慢性支原体感染的可能表现包括：细胞增殖速度降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集；但是，唯yi切实有效的检测支原体污染的方法就是采用荧光染色 (例如：Hoechst 33258)、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或者微生物学测定技术定期检测培养物.
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本文介绍的活细胞成像的细胞培养具有以下优势（1）不再有介质耗尽该系统使用连续灌注，为细胞创造稳定的环境，无需任何手动操作。（2）实时药物接触注入多达10种不同的液体。编程注射序列并自动化您的实验以便获得更好的重复性。适用于3D细胞培养和药物筛选。（3）没有剪切应力MicroSlides旨在避免对细胞施加剪切应力，细胞不直接进入流动。细胞培养可以兼容的生物ADHERENT MAMMALIAN CELLS
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本文介绍的活细胞成像的细胞培养具有以下优势（1）不再有介质耗尽该系统使用连续灌注，为细胞创造稳定的环境，无需任何手动操作。（2）实时药物接触注入多达10种不同的液体。编程注射序列并自动化您的实验以便获得更好的重复性。适用于3D细胞培养和药物筛选。（3）没有剪切应力MicroSlides旨在避免对细胞施加剪切应力，细胞不直接进入流动。细胞培养可以兼容的生物
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WORM EMBRYOS细胞培养用的实验仪器组件细胞培养实验装置连接示意图Tip：介质或药物切换还可以进行培养基转换以使细胞暴露于不同的药物或条件。Tip：不再有气泡可以在MicroSlide之前添加气泡捕集器，以确保气泡不会进入芯片。（对于实验通路上气泡的产生和去除方法，可以点击 如何去除微流控实验通路上的气泡？这篇博文。）如何使用微流控活细胞灌注套装？1、在开始实验之前，用70%乙醇冲洗MicroSlide，储液器以及所有导管和连接器以确保无菌。请确保在生物安全罩下执行以下所有步骤以避免污染。2、用培养基填充储液器并将储液器连接到流量控制器3、将储液池连接到MicroSlide如何填充MicroSlide？1、将MicroSlide连接到Perfusion Pack后，如图所示倾斜设备。使用Elveflow智能界面软件ESI激活压力泵直到全部的三个储液槽都被填充1/4后再关闭压力泵。2、用微量移液管向每个孔中加入10-30μL样品3、从MicroSlide上取下粘合剂衬垫并用盖子密封，然后用拇指压下密封盖子。如何在芯片上进行细胞培养？在实验过程中，MicroSlide和储液器可放置在培养箱或环境室内，而OB1和流量传感器则留在室外。可以使用较长的导管将仪器放在培养箱的外面，如下图所示。Elveflow微流控OB1压力控制器的详细介绍：Elveflow微流控压力泵/压力控制器OB1（四通道）简要介绍
更加详细的内容介绍，请查看如下链接：http://blog.sina.com.cn/fangdzxx
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进入21世纪以来，生物学进入突破性的发展阶段，生命科学在自然学科中位置起了革命性的变化。其中分子生物学，遗传学，细胞生物学，发育生物学，神经学科，生态学，空间生命科学等学科会逐渐发展成为带头学科。
分子生物学（包括分子遗传学）在生命科学中的主流地位，以及它在推动整个生命科学发展中所起的巨大作用是无可争辩的。细胞是生命活动基本的结构与功能单位，细胞生物学作为生物科学的基础学科地位也需给予重视。提到细胞培养，按照目前的细胞分类主要分为：悬浮细胞和贴壁细胞。而悬浮细胞的培养更是现在生命科学中主流、GX的细胞培养。而悬浮细胞培养实验所需容器也成为科学家工作中的基础工具。
目前常见的三种悬浮细胞培养主要器皿：
1. 三角摇瓶(Erlenmeyer flask)
1861年德国科学家Erlenmeyer为了确保样品反应瓶的受热稳定性，改进了加热容器，发明了锥形瓶。锥形瓶的杰出体现在它的特殊形状上；比起圆形烧杯来说，这种特殊形状增加了器械的稳定性，不易打翻；另外，在震荡过程中，锥形瓶的“瓶颈”让瓶内液体不易溅出，因此在悬浮细胞培养过程中培养液就不会飞溅出容器中，从而保证了反应体系的稳定性。现在典型培养CHO、SF9、NK细胞等，都会选摇瓶进行培养。理论上为了保证很好的溶氧量，摇瓶培养装液量大概为容器体积的10%,实际可能有所增加。
2. THOMSON细胞培养瓶
Thomson OptimumGrowth™ 培养瓶，在哺乳动物细胞及昆虫细胞培养中，细胞表现活力强且蛋白表达量大。Thomson 所有型号的瓶子在细胞培养中，细胞成活率和活性都有显著提高。得益于Thomson 培养瓶独特的低剪切力扰流板，提高通气效率，因此Thomson的装液量可以达到总体积的60%。其他类型的摇瓶ZD装液量只有总体积的30%。Thomson 培养瓶使细胞健康生长，从而提高膜蛋白，分泌蛋白和单抗等目的产物表达量；使昆虫细胞蛋白表达量提高200%。对于一些稳定细胞和瞬时表达细胞，蛋白表达量可以提高300%。
使用Thomson 培养瓶，装液体积比例提高，单位体积表达量的增加。可以大量节省培养瓶和培养基的消耗。Thomson 培养瓶，具有高重复性，不同批可扩展性次细胞生长以及产量具有很高的一致性。
3. 冯巴赫瓶（Fernbach）
以法国生物学家AugusteFernbach的名字命名的培养瓶，其实在摇瓶的基础上进行了改进。增大了摇瓶的底部面积，因此增加了培养基和空气中的氧气交换面积。平开口和螺纹开口两种选择，因此可选择GL45透气盖。大开口降低了转移培养基的难度。底部的挡板，增加瓶子摇晃时的液体流动以增大液体与氧的接触概率。相比普通摇瓶，巴赫瓶更能提高产物产率。
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细胞培养的步骤及注意事项
一、 复苏
1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。
3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5. 3天换一次培养基。
二、 传代
1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2. 把原有培养基吸掉。
3. 加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。
4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。
三、 冻存把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。 冻存液的配制： 70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
细胞培养的步骤及注意事项,先和大家介绍到这，如果想要了解更多离心管的信息，可以关注天津本生生物，业给生物医药客户提供生物实验室检测耗材，欢迎广大客户来询。
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