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前言

在PCR检测过程中，不可否认的是，没有任何检测是100%准确的，比如我们可能也曾听过假阳性这个名词，那为什么会出现假阳性呢?这其实跟实验操作过程造成的污染相关，在实验开展过程中，主要有4种污染途径：标本间交叉污染、PCR试剂污染、PCR扩增产物污染、实验室克隆质粒污染。

如何对污染进行监测？

1. 阳性对照

在建立PCR实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否符合理论要求的一个重要的参考标志，阳性对照要选择扩增度中等、复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2. 阴性对照

每次PCR试验务必做阴性对照，它包括：①标本对照，被检标本是血清就用鉴定后的正常血清做对照，被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞做对照；②试剂对照，在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。

3. 重复性实验

4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增

如何避免PCR污染？

实验室防污染是重中之重，毕竟影响最终检测结果，那么我们有哪些防污染的方法呢？

除了注意避免人工操作引入的污染，我们在实验时应设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增带的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应由一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。同时减少PCR循环次数，PCR产物达到检测水平就适可而止。

在细胞培养系列文章的前两弹中，我们介绍了细胞培养相关知识以及细胞房应该如何建设。那么在细胞培养最终章，我们将视线聚焦到常常会影响大家实验进程的一部分——细胞污染。

什么是细胞污染？

凡在细胞培养环境中混入对细胞生长以及生存有害的成分以及造成细胞不纯的异物都应视为污染。

一般情况下，细胞污染根据污染源的不同，可分为物理污染、化学污染和生物污染。

一、物理污染

物理污染是细胞培养过程中最容易被实验人员忽视的一种污染，往往是由一些放射性物质、辐射、或者是温度和其他物理环境的变化引发的。

这些物理性的变化会改变细胞培养体系中的一些生化成分，进而影响细胞的生长，导致细胞生长受抑制甚至死亡，或者细胞的代谢发生变化。

如何避免物理污染的产生？

通过合理设计细胞房布局和规范实验操作可以大大降低物理污染的概率。

1、合理设计实验室布局

一些会引发机械震动的设备如涡旋振动仪、离心机等，建议不要放在二氧化碳培养箱附近。常用试剂按照存放要求（4℃或者-20℃的温度条件下，某些特殊试剂有避光的要求）置于固定的位置，并且避免周围有同位素或者其他放射性物质的存在。

2、规范实验操作

培养箱在使用过程中，尽量避免频繁开关门以免造成二氧化碳浓度和温度的长时间或者大幅度的波动。处理细胞（如进行传代操作）时，也不宜长时间让细胞处于室温状态，影响其生长。

用于细胞培养的培养基、缓冲液、胎牛血清等，一般情况下需保证温度在37℃左右时再用于细胞，以免温度过低损伤细胞。

二、化学污染

化学污染往往存在于培养环境的各种介质中，是造成细胞培养过程中常见的污染之一。培养介质中的杂质、水、试剂、耗材、以及常用的玻璃器皿等都可能造成化学污染。

一些常用的玻璃器皿，清洗不到位也会导致一些清洗剂的残留，进而影响其盛放试剂的纯净度。

在细胞培养过程最常使用到的水（包括蒸馏水、双蒸水、超纯水等），或多或少都会存在一些杂质。即使是去除了金属离子、内毒素等的超纯水，也会随着放置时间纯净度会下降，在实验室中尽量需要现配现用。另外，大部分自行配制的试剂溶液，依据性质不同需要通过过滤或者高温灭菌的方式除去其中的杂质。

如何避免化学污染的产生？

严格清洗实验室常用器皿，以及控制用水和试剂能极大的降低化学污染的风险。

细胞实验常用的玻璃器皿建议进行多层级清洗再用蒸馏水润洗灭菌后使用；实验室用水建议即配即用。一些试剂如胎牛血清这种细胞培养过程中必不可少的。但由于血液物质的成分复杂性，和生产工艺的成熟度不同，导致每一批次的血清制品都会有略微的差别。尽可能的使用同一批次的血清产品，是保证化学环境稳定的前提。

三、生物污染

生物污染是细胞培养新手最容易遇到的一种污染情况。通常情况下科研人员普遍认知的污染是细菌污染，其实生物污染还包含真菌、病毒、支原体、酵母等其他微生物以及不同细胞之间的交叉污染。

常见的细菌通常是大肠杆菌、葡萄球菌等。细菌污染比较容易察觉，细菌的快速增殖会产生大量的酸性代谢物质，导致培养基迅速变黄，并有肉眼可见的浑浊现象。在细胞培养过程中，如无特殊要求，在培养液中加入一定浓度的抗生素是有助于抵御细菌污染的。

相较而下，真菌的生长就会缓慢许多，其对细胞培养体系的影响也相对较慢。一般情况下，实验室常见的产生污染的真菌多为白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌等。这些菌株在污染后期往往会形成白色或者是黄色的肉眼可见的漂浮物，在高倍显微镜下也可以看到明显的菌丝。

而对于病毒和支原体这种污染情况，则更难在污染初期被研究人员察觉，并且会在潜移默化中对细胞的生长增殖产生一定的危害与影响。

另外，细胞污染也是一种生物污染，如在多种细胞培养的过程中，某细胞混入了另一种细胞的培养体系。

如何避免生物污染的产生？

以上生物污染的发生，往往是实验人员在同时进行多次细胞传代、操作时未更换吸头或是共用移液管等造成的。严格标准化执行无菌操作流程就可以避免。
同时，实验人员也需要保持个人卫生，在开始实验操作前，应保证实验服、手套、口罩等防护措施准备齐全。

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