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什么是核酸检测？

核酸检测是指通过特殊的技术手段检测临床样本中是否存在特定的病原体核酸，从而诊断患者的感染原因。新型肺炎核酸检测主要是看它的核酸，通过实时聚合酶链反应，即RT-PCR方法来检测。检测的样本鼻拭子或咽拭子从鼻腔或者口腔用棉签沾取样本再出来做一个检测，这是目前简单、快捷的一个方法。

核酸检测中病毒灭活样本保存液的优势是什么呢？

1.降低RNA降解造成假阴性

核酸样本保存条件苛刻，RNA极易裂解，4℃仅可存放24h，运输过程过长RNA就会出现提前被降解的现象，从而导致检测假阴性增多。病毒样本保存液是采样管内一种病毒样本保护性运输介质，防止病毒采样后不能及时检测在送检过程中病毒降解，避免因病毒在检测途中提前降解造成假阴性。

2.减小核酸提取过程的感染

所有人都知道新冠肺炎的传染性高，检测过程中稍有不慎会被感染。核酸检测需要有专门的仪器和标准的分子检测实验室，需要PCR认证人员操作，步骤繁琐，全程需要5~8个小时，过程中感染风险大。

病毒灭活样本保存液采用裂解盐可以快速对呼吸道病原体进行灭活、保存，使样品失去感染性。由于是灭活病毒而不用培养病毒，首先需要的就是对病毒进行裂解失活、破坏其膜蛋白释放核酸，大大降低了核酸提取过程中被感染的危险度。

德晟研发生产的病毒样本保存液分为病毒灭活样本保存液和非灭活型，非灭活型病毒样本保存液可以完整保护好病毒的蛋白，可用于细胞培养。针对不同的需求所适用的病毒样本保存液也会有所不同，有需求的可直接来电咨询。

根据《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》通知，“人群筛查应选择具有病毒灭活功能，如含胍盐（异硫氰酸胍或盐酸胍等）或表面活性剂的采样管。”

灭活型病毒采样管可高效灭活病毒，保护病毒核酸不被降解，且能在常温下保存较长时间，为样品保存及运输节省成本。选择灭活效果好的病毒采样管，有助于确保后续核酸检测质量。

本期实验，我们选取逗邦®一次性使用病毒采样管进行灭活效果测试，过程如下：

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实验材料

病毒采样管：

逗邦®一次性使用病毒采样管（灭活型）

实验材料：

慢病毒（吉凯基因，GCNL0319432），HEK293T细胞

核酸提取试剂盒和提取仪：

逗邦®（BNP027-2B, M32)

新冠荧光PCR试剂盒：

圣湘（N083-5X0001）

逗邦®一次性使用病毒采样管（灭活型）

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实验方法

参考《消毒技术规范》（2002版）病毒灭活试验中描述的检测方法，确定病毒保存管灭活能力。

步骤一：细胞培养

将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1×104/mL，按照100μL/孔的体积，每个梯度的病毒做三个复孔，计算所需接种孔数，将细胞缓慢均匀接种至96孔板中。放入37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。

步骤二：慢病毒稀释

将病毒滴度为107-108TU/mL的慢病毒按10倍梯度进行稀释，连续稀释3个梯度。

步骤三：病毒灭活

把稀释好的病毒置于室温条件下，与灭活款病毒保存液（批号：220201/220207/220211）按1:1体积比进行混合，置于室温下分别放置1min、5min和10 min进行灭活。

步骤四：终止灭活

采用病毒分离培养基（可用DMEM完全培养基替代）进行1000倍稀释以中和灭活保存液，终止灭活。

阴性对照：为病毒分离培养基对灭活款病毒保存液稀释1000倍的混合液；

阳性对照：为病毒分离培养基对病毒原液稀释1000倍的混合液。

步骤五：病毒孵育

将事先培养的HEK293T细胞中吸弃细胞培养基，每孔加入100μL准备好的病毒混合液，和对应的阳性对照、阴性对照。病毒孵育3小时，每隔30分钟从培养箱中取出晃动一次。

步骤六：细胞培养

孵育结束后，将病毒液吸去，每孔中加入100μL DMEM完全培养基，将96孔板置于37℃，5% CO2培养箱中培养，并观察细胞状态。

步骤七：荧光细胞观察与计数

继续培养48-72h，期间观察细胞状态，若细胞培养液变黄，应换液，对荧光细胞个数适量的孔进行计数，计算病毒滴度。

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实验结果

图1：三批次灭活款病毒保存管在病毒灭活

不同时间后细胞生长情况

表1：三批次灭活款病毒保存管在病毒灭活

不同时间后病毒滴度情况

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实验结论

由图1和表1数据可以看出，慢病毒经灭活1min、5min和10min后感染HEK293T细胞后，在显微镜明场下细胞生长正常；三批次的灭活款病毒保存管与病毒作用5min后，可以有效灭活病毒。