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 微量凯氏定氮法

 (Mirco Kjeldahl determine)

一、目的

   1、学习微量凯氏定氮法的原理

   2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含量的测定，未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

二、原理

   凯氏定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量。

   天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进-步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。

    但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下:

    浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氮，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止,后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)计算出待测物中的氮量。

    滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6,NH4H2BO3的蓝色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。

    本法适用范围0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于2%。

三、材料、试剂与器具

(一)材料

人的血清或猪的血清

(二)试剂

1、 浓硫酸(化学纯)

2、30%氢氧化钠(分析纯)溶液

3、0.9%NaC1 溶液

4、硫酸钾一硫酸铜混合物:硫酸钾与硫酸铜(CuSO4、 5H2O)以3: 1 (W/W)的配比混合研磨成粉末。

5、2%硼酸

6、混合指示剂的配制:

    方法一:取50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。

    方法二: 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。

    本指示剂的变色范围为pH5.2→5.4→>5.6

                         紫红色 灰色 绿色

 7.0.0100M HC1

 8.硼酸一指示剂混合液:取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。(约加1毫升左右混合指示剂)

 9.标准硫酸铵溶液(0.3 毫克氮/毫升)

(三)器具

1、凯氏烧瓶

2、消化架

3、吸量管(1毫升、2毫升)

4、量筒(10毫升)

5、凯氏定氮蒸馏装置

6、微量滴定管(3毫升、5毫升，可读至0.02毫升)

7、锥形瓶(50-100毫升)

8、容量瓶(50 毫升)

四、操作步骤

(一)样品的处理

    血清样品:取人血(或猪血)，放于离心管中，于冰箱中放置过液，次8离心除去凝xue块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升,仔细混匀备用。

   固体样品:某一固体样品中的含氮量是100克该物质(千重中所含氮的克数)来表示(%)。因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般样品干燥的温度都采用105°C，因为非游离的水都不能在100°C以下烘干。

   在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，然后置105°C的烘箱内干燥4小时。用坩埚将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称量--次，直到两次称量的数量不变，即达恒重。

 (二)消化

   取2个50毫升的凯氏烧瓶，向号烧瓶内加2毫升稀释血清溶液(或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固体粉末)。注意，用吸量管直接将溶液(或用试管加入固体样品)加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入2毫升水作空白对照。

   在每个烧瓶内加入硫酸钾一硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3毫升，小瓷片两粒,摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上,每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。

   在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10 毫升(注意慢加，边加边摇)。冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，后定容至刻度摇匀，做上记号备用。

(三)蒸馏

1、仪器的洗涤:仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。

蒸馏器(图1-1)有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下:

    开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出(水不宜开得过大以免水从G管溢出)。开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10毫升入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用。(可用PH试纸检查。)

    A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气室M相遇，M管插入盛有定量酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为指形冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时B室进消化好的样品及NaOH,二者反应产生氨，B室经M管进入锥形瓶中的酸吸收。

 2、滴定标准样品

    先用标准硫酸铵溶液试验2-3 次。蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部即可。

    取3个50毫升的锥形瓶，各准确加入10毫升硼酸(内加有混合指示剂)。用表面皿复盖备用。

    加样:用吸量管吸取1毫升标准硫酸铵溶液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸一混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠8毫升，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。

    蒸馏:用酒精灯加热(应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸馏5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟,后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。)

 3、样品及空白蒸馏:用吸量管分别吸取1毫升样品和1毫升蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。

 4、滴定:蒸馏完毕，用0.0100N标准盐酸溶液滴定锥瓶内溶液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。

(四)计算

   式中: A为漓定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数； C为称量样品的克数:0.0100为盐酸的当量浓度(实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写)； 14 为氮的原子量；6.25为常数(1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮)。
    若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。首先需向样品中加入三lv乙酸，使其终浓度为5%，然后测定未加三lv乙酸的样品及加入三lv乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氨，再进一步算出；蛋白质的含量。
           蛋白氨=总氮-非蛋白氨
           蛋白质含量(克%) =蛋白氮X6.25

五、注意事项

   1、凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。

   2、普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。

六、实验报告

绘画蒸馏装置图，计算待测样品的总氮量和蛋白质含量

七、思考题

1、正式测定未知样品前为什么必须测定标准硫酸铵的含氮量及空白?

2、写出以下各步的化学反应式:

①蛋白质消化

②氨的蒸馏

❸氨的滴定

3.指出本测定方法产生的误差的原因。

1 前言

肝素钙主要用于血液透析时预防血凝块形成，也可用于ZL深部静脉血栓形成。参照《2015 版 ZG药典 第四部 通则 0704 氮测定法 第三法（定氮仪法）》测定肝素钙中的氮含量。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

K1160 全自动凯氏定氮仪，SH420F 石墨消解仪，分析天平。

2.2 试剂

硫酸（分析纯），催化剂片（分析纯无水硫酸钾 3g 和分析纯无水硫酸铜 0.2g），20g/L硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，40%氢氧化钠。

3 实验方法

3.1 取样

将样品外包装打开，混匀样品，精确称取 0.1g 左右（精确值 0.1mg），用称量纸包好放入消化管内，然后分别加入 3g 硫酸钾与 0.2g 硫酸铜，沿消化管壁加硫酸 10mL。

3.2 消解

利用石墨消解炉进行消解，将消化管放在石墨炉上，盖上排气罩，连接废气吸收系统，

消化过程采用曲线升温模式，设定消解参数如表 1：

表 1 消解参数设置

3.3 测试

将消化管放置于凯氏定氮仪上，定氮仪参数设置如表 2：

表 2 定氮仪参数设置

4 测试结果

4.1 实验结果

4.2 结论

通过实验数据可以看出，测定肝素钙氮含量平均值为 1.8412%。

参考文献：

[1] 2015 版 ZG药典 第四部 通则 0704 氮测定法 第三法（定氮仪法）[M]

1 前言

硝态氮肥，是指氮素以硝酸盐形态存在的氮肥。如硝酸钠、硝酸钙、硝酸铵钾、硝铵磷等。特点是：临界吸湿点相对湿度低，易吸湿结块；易溶于水，易被作物吸收。较适合施用于旱地作物，如玉米、甜菜、烟草等。本实验参照《GB/T 22923-2008 肥料中氮、磷、钾的自动分析仪测定法》中的方法对硝态氮肥的氮含量进行测定。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

K1160 全自动凯氏定氮仪，SH420F 石墨消解仪，分析天平 。

2.2 试剂

盐酸（分析纯），20g/L 硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，40%氢氧化钠，0.1mol/L硫酸标准滴定液。

3 实验方法

3.1 样品前处理

称取 0.5g 铬粉加入消化管中，再精密称取样品 0.1g（精确至 0.1mg）左右，用纯水将样品冲入消化管。将消化管置于通风橱中，向消化管中加入 5mL 盐酸，在室温下至少静置 5min，但不超过 10min。置消化管于已预先升温到 300℃的消化炉中，插上梨形玻璃漏斗，加热至沸腾后 1min~2min，注意，不能蒸干，冷却，冲洗漏斗及消化管壁。

3.2 测试

表 1 定氮仪参数设置

4 结果与讨论

4.1 实验结果

表 2 硝态氮肥料中氮含量测试结果

4.2 结论

结果表明本次测试的硝态氮肥料中氮含量分别为 13.710%、31.765%和 31.068%。且测试结果 RSD 分别为 0.066%、0.103%和 0.042%，重复性较好。

参考文献

[1]GB/T 22923-2008 肥料中氮、磷、钾的自动分析仪测定法[S]. 

注意事项

此方法适用于仅含有硝态氮或含有硝态氮和铵态氮的肥料样品，不适用于含有有机物及酰胺态氮的样品。

1 前言

活性炭是由木质、煤质和石油焦等含碳的原料经热解、活化加工制备而成，粉状活性炭是非常微细的粉末，绝大部分可通过 200 目筛网。它主要应用于味精、柠檬酸、氨基酸、啤酒等的脱色提纯。其氮含量测定原理是活性炭与浓硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使含氮有机质分解，分解生成的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量，计算样品中的氮含量。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

K1160 全自动凯氏定氮仪；SH420F 石墨消解仪；电子分析天平。

2.2 试剂

硫酸（分析纯），20g/L 硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，40%氢氧化钠，混合催化剂片（3gK₂SO₄、0.2gCuSO₄），0.1mol/L 硫酸标准滴定液。

3 实验方法

3.1 取样

准确称取混匀样品 0.2g（精确值 0.1mg）左右，加入消化管，再加入混合催化剂 3gK₂SO₄、0.2gCuSO₄，加入 10mL 浓硫酸，然后再加入 0.2g 高锰酸钾。

3.2 消解

利用石墨消解炉进行消解，将消化管放在石墨炉上，盖上排气罩，连接废气吸收系统，消化完毕后，将消化管取下冷却至室温。消化过程采用曲线升温模式，设定消解参数：

3.3 测试

将消化管放置于定氮仪上。定氮仪设置程序如下：

4 结果与讨论

4.1 实验结果

4.2 结论

通过实验数据可以看出，该粉状活性炭样品测定的氮含量平均值为 2.7191%。以上数据显示，使用 K1160 全自动凯氏定氮仪测定粉状活性炭中氮的含量，所得结果误差符合《GB/T 19227-2008 煤中氮的测定方法》标准要求的重复性限为 0.08%。

参考文献

[1]GB/T 19227-2008 煤中氮的测定方法[S]. 

注意事项

加高锰酸钾时反应很剧烈，要在通风橱内进行，戴好护目镜，做好防护措施。剧烈反应结束放置 10min 再进行消解。

1 前言

瓜尔胶为大分子天然亲水胶体，属于天然半乳甘露聚糖，品质改良剂之一，一种天然的增稠剂。外观是从白色到微黄色的自由流动粉末，能溶于冷水或热水，遇水后及形成胶状物质，达到迅速增稠的功效。主要分为食品级和工业级（油田使用的属于工业级）两种。参照《2015 版 ZG药典 第四部 通则 0704 氮测定法 第三法（定氮仪法）》测定瓜尔胶中的氮含量。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

K1160 全自动凯氏定氮仪，SH420F 石墨消解仪，分析天平。

2.2 试剂

硫酸（分析纯），催化剂片（分析纯无水硫酸钾 3g 和分析纯无水硫酸铜 0.2g），20g/L硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，40%氢氧化钠。

3 实验方法

3.1 取样

将样品外包装打开，混匀样品，精确称取 0.3g 左右（精确值 0.1mg），用称量纸包好放入消化管内，然后分别加入 3g 硫酸钾与 0.2g 硫酸铜，沿消化管壁加硫酸 10mL。

3.2 消解

利用石墨消解炉进行消解，将消化管放在石墨炉上，盖上排气罩，连接废气吸收系统，消化过程采用曲线升温模式，设定消解参数如表 1：

表 1 消解参数设置

3.3 测试

将消化管放置于凯氏定氮仪上，定氮仪参数设置如表 2：

表 2 定氮仪参数设置

4 测试结果

4.1 实验结果

4.2 结论

通过实验数据可以看出，测定瓜尔胶氮含量平均值为 1.3658%。

参考文献

[1] 2015 版 ZG药典 第四部 通则 0704 氮测定法 第三法（定氮仪法）[M]