怎样用双缩脲法测定蛋白质？

绝代野伊 2013-07-12 02:37:41 517 浏览

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69670386 2013-07-13 00:00:00

楼主你好：由于蛋白质分子中含有肽键(一C()_一NH一)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的Z大吸收波长为560 nm。双缩脲法灵敏度较低，但操作简单快速，是生物化学领域中测定蛋白质含量的常用方法之一，也可用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。双缩脲法 1．原理当脲(尿素)被小心地加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲(也叫双缩脲)。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有肽键(一C()_一NH一)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的Z大吸收波长为560 nm。双缩脲法灵敏度较低，但操作简单快速，是生物化学领域中测定蛋白质含量的常用方法之一，也可用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 2．主要仪器 ①分光光度计。 ②离心机(4 000 r／min)。 3．试剂 ①10 mol??L叫氢氯化钾。 ②碱性硫酸铜溶液：将lO mI。10 mol??I。叫氢氧化钾和20 mL 25％酒石酸钾钠溶液加到930 mI。蒸馏水中，剧烈搅拌，同时慢慢加人40 mI。4％硫酸铜溶液。配制试剂加入硫酸铜溶液时，必须剧烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。 ③四氯化碳。 4．操作步骤 ①标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、110 mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50 mL纳氏比色管中，然后各加入1 mI。四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50 mL，振摇10 min，静置1 h，取上层清液离心5 min，取离心分离后的透明液于比色皿中。（更多详细咨询请参考国家标准物质网www.rmhot.com）在560nm波长下以蒸馏水作参比液，调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。 ②样品的测定：准确称取样品适量(即使蛋白质含量在40～110 mg)于50 mI。纳氏比色管中，加1 mI。四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。根据测得的A值在标准曲线上可查得蛋白质质量(mg)，进而由此求得蛋白质含量。 5．计算 6．说明 ①蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。 ②含脂肪高的样品应预先用脱脂后再测定。

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何嫚秋 2013-07-13 00:00:00

（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材 1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4&8226;5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6&8226;4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的diyi支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

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