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- 周易大发财 2017-09-23 00:00:00
- 基本不会 SDS是表面活性剂,但是对DNA结构的影响较小。 可以用SDS法裂解细胞膜,使蛋白质变性,进而抽提DNA~ NA会迅速被降解,因为Z终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢?实话告诉你,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是Z佳 的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是 由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH,即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下),自然就难GX率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS也是碱性的,只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问,既然是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点:diyi,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合(象对待女孩子一样),不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦,后面我再详细说明。 每个人都知道,溶液III加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉淀的本质。Z容易产生的误解是,当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑,往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现,显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
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