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  微影中心1 2010-12-03 00:00:00

  提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法 提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行 SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离 CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~ DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了 以下是一些具体方法，希望有用 基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法，超声波法，研磨法，冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法，碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl，0.1mol/LEDTA，o.5%SDS)，混匀。 4、加入25ul蛋白酶K，使终浓度达到100ug/ml，混匀，50℃水浴3h， 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL，混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。 2500rpm，离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min，室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。 外周血DNA提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80?C冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。 氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer： 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；Z后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。 ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；Z后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）： 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；Z后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。 NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。 试验步骤： 1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min，倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。 2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml，至终浓度为100-200ug/ml，上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。 4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA，置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 真核细胞DNA的制备 一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则： 1、防止和YZDNase对DNA的降解。 2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 试剂准备： 1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。 2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。 3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K 6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤： 材料处理： 1、新鲜或冰冻组织处理： 1)取组织块0.3-0.5cm3，剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。 4)60°C水浴1-3hr。 2、培养细胞处理： 1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 2)离心4000g×5min，去除上清液。 3)加10倍体积的裂解缓冲液。 4)50-55°C水浴1-2hr。 DNA提取： 1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。 3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。 8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。 9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。 植物组织中DNA的提取 试验原理： 脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可YZ酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 植物DNA的SDS提取法： 试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol／LHCl。 10、0.2mol/LNaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。 12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13、0.05mol/LNaOH。 14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 实验步骤： 1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。 2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。 3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的Z终浓度为1mol/L。 5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。 6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。 7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使Z终浓度为1×SSC。 8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。 9、加入已处理的Rnase溶液，使其Z后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。 10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。 11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。 植物DNA的CTAB提取法： 试验步骤： 1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。 2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。 3、取出离心管，冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。 4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。 5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。 6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。 7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。 8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。 9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。 细菌DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（YZRNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤： 1、抽提缓冲液65℃预热。 2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12，000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12，000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。 7、以2，000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。 较为常用的细菌DNA提取方法： 实验步骤： 1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。 2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl，充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 真菌DNA提取总结的两种方法： diyi种方法： 试验步骤： 1、取真菌菌丝0.5g，在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。 3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。 4、以4℃，1000rpm，离心5min。 5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10，000rpm，离心5min。 6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，静置约30min。 7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中。 8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。 9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10，000rpm，离心5min。 10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc，2.5倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。 11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，-20℃保存备用。 DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。 第二种方法： 试验步骤： 1、真菌菌丝0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min，期间混匀2-3次。 3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。 4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10，000rpm，4℃离心5min）。 5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30min。 6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中。 7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。 8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10，000rpm，离心5min。 9、取上清，1/10V3MNaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。 10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，-20℃保存备用。 植物基因组提取(CATB法) 作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论 一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解， 再定容至200ml灭菌， 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 （1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中； （8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min； （13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解； （15）置于-20℃保存、备用。 2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。 六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTAYZ酶的活性外，diyi步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

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