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　　此次实验主要是为膝关节滑液组织制备单细胞，让我们一起来看看净信单细胞制备仪是如何制备膝关节滑液组织单细胞悬液，对其样品前处理效果和悬液效果如何？

　　实验地点：上海**大学医学院东区单细胞中心

　　实验仪器：单细胞悬液制备仪（温控型）JX-CKSM-6WK

　　样品前处理制备实验步骤：

　　1、打开仪器电源开关，将仪器界面中的加热点开预热一段时间持恒温。

　　2、将组织稍微剪切成小块，放入净信2ml研磨管中。

　　3、加入净信消化酶旋上盖子，上下微微晃动将其组织和消化酶均匀混合。

　　4、将混合好的研磨管放入加热模块中，再将研磨管放入热板中，盖上盖子。

　　5、启动设备，待设备停止运行后打开仪器盖子，取出样品管

　　6、将样品管中的液体和剩下的组织一起倒入过滤管中，再加入终止液后得到浑浊的液体，即单细胞悬液。

　　样品处理前后效果图：

　　显微镜下的细胞呈现：

　　实验样品组织制备注意事项：

　　1、消化酶和终止液均需要在冷冻环境下保存

　　2、消化酶解冻时需在常温条件下解冻，不可以放入水浴或者其他加热仪器中解冻，温度升高对酶的活性会有很大的影响。

实验目的：制备小鼠大脑的单细胞悬液

实验仪器：单细胞悬液制备仪，研磨套装管，滤管，移液枪，培养皿，镊子，手术刀

实验试剂：PBS液，净信消化酶，终止液

操作步骤：

1、开机预热，打开加热模块1，加热模块2

2、取活体组织后，放入PBS液中去红，然后取20-50mg（约小米粒大小），再分成若干等分

3、把消化酶用移液器加入研磨套装管中，将加满消化酶的离心管放入预热模块中预热几分钟

4、将处理好的组织用镊子转移到加满消化酶的离心管中

5、将装满消化酶和组织的离心管放置到加热板中，选择25分钟程序，开始运行

6、程序结束取出离心管，将消化好的组织液转移到过滤管中，即得到一管单细胞悬液

仪器介绍：

上海净信单细胞制备仪JX-CKSM-6WK（6通道加热型）是一种集成金属浴消化与温和剪切组织的新一代细胞悬液制备设备，应用于流式细胞术/单细胞测序/原代细胞培养等实验，具有起始组织量小，时间短，细胞得率高，细胞活性高的特点。采用国际DIN方法设计，低噪音，使用方便，性能稳定。

应用领域：肿瘤研究 心血管研究 干细胞研究 免疫研究 神经科学研究

产品应用：

单细胞测序（Single-Cell RNASeq)

多色流式分析（Multicolor Flow Cytometry)

质谱流式细胞计数（Mass Cytometry)

原代细胞分离培养（Primary Cell Isolation And Culture)

细胞ZLCAR-T

实验目的：制备小鼠肝、肾、脾的单细胞悬液

实验仪器：单细胞悬液制备仪，研磨套装管，滤管，移液枪，培养皿，镊子，手术刀

实验试剂：PBS液，净信消化酶，终止液

操作步骤：

1、开机预热，打开加热模块1，加热模块2

2、取活体组织后，放入PBS液中去红，然后取样品

3、把消化酶用移液器加入研磨套装管中，将加满消化酶的离心管放入预热模块中预热若干分钟

4、将处理好的组织用镊子转移到加满消化酶的离心管中

5、将装满消化酶和组织的离心管放置到加热板中，选择25分钟程序，开始运行

6、程序结束取出离心管，将消化好的组织液转移到过滤管中，即得到一管单细胞悬液

肝脏组织

脾组织

肾脏组织

仪器介绍：单细胞制备仪是一种集成金属浴消化与温和剪切组织的新一代细胞悬液制备设备，应用于流式细胞术/单细胞测序/原代细胞培养等实验，具有起始组织量小，时间短，细胞得率高，细胞活性高的特点。采用国际DIN方法设计，低噪音，使用方便，性能稳定，带加热功能，对样品的消化处理过程始终处在恒温状态。

优势：

1、组织高利用率、单细胞化过程高效、单细胞高产出

2、针对临床穿刺样本，使组织的利用率达到100%，细胞产量可达10万个以上v

3、针对原细胞培养样本，在15min内完成组织到单细胞过程，降低细胞逆境时间，提高细胞存活率

4、针对组织单细胞测序，快速完成单细胞化处理，获得高产且活率在85%以上的单细胞，以小鼠组织为例：

5、针对不同的样本选择不同的程序（6组预设程序），处理样品量4*2ml/6*2ml/8*2ml

作为构成神经系统的基本结构和功能单位，神经细胞的体外分离、培养在神经科学研究中占据前沿地位。由于神经元分离后不会再次分裂、增殖，因此在进行相关细胞实验时，需要高效地制备高质量原代神经细胞保证实验材料的供应。

然而神经细胞的分离制备难度较大，相较于新生鼠，成年鼠脑的解离更复杂，需要机械和酶解联合作用来降解细胞外基质，同时大量的髓鞘碎片和红细胞也会干扰下游实验。

那么，如何快速制备高质量的大/小鼠神经细胞悬液样本呢？接下来，我们从实验仪器及材料、实验步骤和实验结果一一介绍，希望对你的实验有所帮助。

实验仪器及材料

瑞沃德 DSC-400单细胞悬液制备仪；

瑞沃德 HJ-400 加热套；

瑞沃德 DHABE-5003大小鼠成年脑组织温和酶解试剂盒；

瑞沃德 SCT-100组织处理管；

70μm 细胞滤器；

瑞沃德眼科手术器械；

细胞培养耗材、移液枪等。

实验步骤

1、按照说明书要求，混合配置酶mix并37℃水浴激活。

2、剥离成年鼠（P>7）脑组织，暂存至盛有HBSS（含Ca2+和Mg2+）的培养皿中，用眼科镊轻轻地将脑组织的血管尽可能去除。

尽可能剔除脑组织上的血管

3、将脑组织和酶mix放于组织处理管中，用剪刀将全脑简单剪成4块。

4、将组织处理管倒置至单细胞悬液制备仪上，安装加热套，运行程序 M_ABrain_Heater_2。

5、润湿细胞滤器，过滤细胞悬液样本，300×g ，离心10 min。

使用细胞筛过滤杂质

6、转移细胞样本至15mL离心管，加入去碎片试剂后混匀，上层铺预冷的PBS，3000×g， 4℃，升速为5，降速为3，离心10min，保留下层细胞后洗涤收集。

去除碎片，收集下层细胞

7、裂红操作（可选）。

8、细胞计数及流式检测。

实验结果

使用瑞沃德单细胞悬液制备仪处理成年小鼠脑组织获得的细胞可达90%，细胞活性高，不影响下游实验。瑞沃德 DHABE-5003大小鼠成年脑组织温和酶解试剂盒，可用于成年大鼠或小鼠(P>7)全脑组织的单细胞悬液制备，可支持脑内所有神经及非神经细胞的分离。

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原代细胞 (primary cell) 是指从机体的组织（如人体组织、小鼠组织等）经特定方法获得单个细胞，并在体外进行模拟机体培养的细胞。原代细胞离体时间较短，生物学特性未发生较大变化，仍保有机体组织的遗传特征，能更好地反映细胞在体内的生长状态，因此可获得与体内生理功能更接近的数据，更适合用于药物测试、细胞分化和转化等实验研究。

原代细胞分离是指使用酶、螯合剂（常用EDTA）以及机械方法处理动物组织，使其分散为单细胞悬液样品，后续在适当的培养体系下使分离的原代细胞进行生存、生长和繁殖的过程。针对不同物种的不同组织类型，其具体的操作流程也要进行调整，常规原代细胞分离流程为取样→预处理→分离处理→过滤清洗→后处理。

01

取样→预处理

取样是原代单细胞悬液制备非常重要的一步，其质量会直接影响到后续处理效果。

操作时，首先根据不同实验需求麻醉或处死动物后进行消毒、固定并切开相应位置皮肤暴露目的组织。

（▲暴露目的组织）

同时不同组织类型，取样时也有细微差别。

其次操作过程中有以下几点也需要注意：

• 严格无菌操作，快速处理；

• 针对不同组织类型控制环境温度；

• 保证工具锋利，减少机械损伤，动作轻柔，保持组织湿润；

• 尽量去除非相关组织，尤其是残留的小血管等；

• 完整记录组织情况、重量等信息。

拿到样本后针对不同分离流程选择不同的预处理方式（如将肿瘤组织剪切到2-4mm左右的小块），如血液细胞等已经是单细胞悬液的样本在简单的离心换液过后就可以直接使用了，其他类型的组织还需要进一步解离。

（▲组织预处理）

02

分离处理

常规组织处理一般有两种方法，分别是通过物理机械剪切和化学生物酶解来实现细胞分离。

物理机械剪切是使用匀浆机打散组织或者使用剪刀、铜网或者组织研磨器进行的剪碎法、网搓法和研磨法。这种方法成本低，操作简单、快速，但对组织机械损伤巨大，而且细胞分散效果不尽人意，只适用于一些质地软且较为松散的软组织。

化学生物酶解法是组织样本预处理之后，在酶的作用下，破坏组织间的胶原纤维和弹性纤维，同时水解粘多糖及其他连接细胞间的蛋白质；或者通过EDTA等化学物质与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞，尤其对上皮组织的分散效果很好。

使用酶解体系进行组织解离时还需注意酶的选择和配比，最常使用胰蛋白酶和胶原酶进行处理。其中胰蛋白酶对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质消化溶解而使细胞分散开，适用于多种组织。

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适用于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。不同的胶原酶适用的组织也会有不同。

除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶这种解离效果强但容易造成细胞损伤以及解离效果弱，但对细胞损伤较小的裂解酶，可以根据实际样本的情况进调整，或者通过复配联用达到更好的效果，例如可以使用透明质酸酶与胶原酶联用消化细胞间基质等。

同时，在进行消化处理的时候佐以机械剪切，便能使组织分散得更加均匀，样本处理效果更好。另外实验操作中还需要注意以下几点：

• 预处理好的组织块需要在缓冲液中清洗，避免影响后续实验；

• 酶量和作用时间应根据组织量及时调整，避免消化时间过长影响细胞状态，期间需要摇晃整个解离体系以保证组织块接触均匀；

• 严格控制温度湿度条件，虽然胰蛋白酶发挥效果的最佳温度是56℃，但是细胞无法承受如此高温，所以需要在37℃环境进行处理，另外还有部分组织需要冷消化处理；

• 酶的保存也需要注意，冻干粉要注意防潮，溶解后避免反复冻融，如蛋白水解酶可以自动分解，因此建议在使用前立即将其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

原代细胞分离过程复杂，同时整个分离处理过程都需要人工参与，机械剪切过程难以控制实验可重复性。随着科技的进步，瑞沃德单细胞悬液制备仪轻松化解这一难题，自主研发的组织处理管、酶解试剂盒和内置不同组织优化处理程序，可将组织制备成高活性单细胞悬液或组织匀浆。

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根据实际样本可在15-30min内完成活性高、均一性好的单细胞悬液制备，大大增加实验可重复性。拥有独立运行的四通道，搭配加热套实现全自动处理，提高组织处理效率。广泛应用在单细胞测序、原代细胞培养、流式分析、细胞分选、细胞治疗等研究领域。

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03

过滤清洗→后处理

在分离处理操作结束后要对样品进行过滤、离心、换液，对获得的单细胞悬液进行细胞计数和活力分析，终止反应并将细胞置于培养体系或相应的缓冲体系中。

（▲活细胞计数）

自动细胞计数仪的使用可以对原代细胞进行精准计数，瑞沃德C100自动细胞计数仪可配合多荧光通道，对悬液中的细胞进行定量分析，并同时显示明场及荧光图像，清晰呈现计数结果及细胞形态。适用于免疫学及疫苗开发、细胞治疗、肿瘤研究、干细胞及代谢研究等研究领域的细胞分析。

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细胞培养是原代细胞分离流程最后一步，瑞沃德二氧化碳培养箱，可精准控制温度、二氧化碳浓度，并且是维持高湿度环境的高性能细胞培养箱。HEPA高效过滤器可有效去除空气中的微粒污染，140℃高温干热灭菌功能可实现培养箱的定期灭菌维护，为原代细胞样品提供稳定洁净的培养环境。

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