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　　实验室细胞培养板步骤

　　1、细胞复苏

　　将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM培养基中(其中胎牛血清约为10%)，轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。

　　加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5%  CO2的细胞培养箱中培养。

　　2、细胞传代

　　当细胞密度达到80%~90%(过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂次数)时，去掉培养基，用1X  PBS清洗2次。

　　加入胰蛋白酶(注意：消化液的量以盖住细胞，消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度)进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

　　加入适量DMEM培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。

　　加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。

　　3、细胞冻存

　　当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用1X   PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入lml冻存液(90%胎牛血清，10%DMSO。   一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞)，放入冻存管内(管内有异丙醇，以温度降低的速度)，立即放入4℃冰箱中冻存30min，然后放入-20℃冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。

　　第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

　　细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

　　4、注意事项

　　(1)预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热;

　　(2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手;

　　(3)正确摆放使用的器械：足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染;

　　(4)点燃酒精灯：注意火焰不能太小;

　　(5)严格的无菌操作;

　　(6)贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化;

　　(7)传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染;

　　(8)传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。

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