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  CH68453622 2018-04-26 00:00:00

  提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。 一）CTAB法 CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。 （二）SDS法 利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（Z常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！ 1、 CTAB法 1） 在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。 对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。 2） 用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5 g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0 ml离心管。 3） 加入800 µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20 min，不时颠倒混匀。 4） 待冷至室温后，加入800 µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000 rpm离心10 min。 5） 上清（~700 µl）转移至另一干净的离心管中，加入5 µl RNaseA贮液，37℃温育30 min。 6） 加入700 µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000 rpm离心10 min。 7） 上清（~600 µl）转移至另一干净的1.5 ml离心管中，加入600 µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20 min。 8） 25℃，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。 9） 去上清，加1 ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000 rpm，离心10 min） 10）凉干DNA，溶于50 µl ddH2O，4℃保存备用。 2、 SDS法 ① 将0.3 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。 ② 加入1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3 μl β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。 ③ 加入0.45 ml 5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。 ④ 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。 ⑤ 转移上清液到另一新离心管中，加5 μl RNaseA贮液，37℃温育30 min。 ⑥ 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000 rpm离心15 min。 ⑦ 转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。 ⑧ 25℃，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。 ⑨ 弃上清，70％乙醇洗两次。 ⑩ 凉干DNA，溶于50 µl ddH2O，4℃保存备用。

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