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Western Blot 是一种用于检测蛋白质以及蛋白质翻译后修饰的常用方法，可以对简单或复杂生物样品中的目标蛋白质进行半定量或定量分析。其操作步骤包括：

•从细胞、组织或体液中制备样品（蛋白质提取和蛋白质浓度测量）

•十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶通过电泳按大小分离蛋白质

•将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上

•封闭膜上的非特异性蛋白

•用特异性一抗探测靶蛋白

•与标记的化学发光或荧光分子偶联的二抗共孵育

•检测反映抗原/抗体结合的信号

•使用软件对目标蛋白条带进行光密度分析

Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中Z常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程，因此任何一个步骤发生错误，都会导致的结果发生变异，从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明，Western Blot的一些关键步骤，例如样品制备方法、跑胶、转膜、抗体的选择以及定量所用的归一化方法，对于可再现的蛋白质印迹结果至关重要。

--样品制备--

Western blot步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备。有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。为了有效地提取蛋白质，应该选择一种合适的均质化方法，该方法可以通过细胞膜的破裂有效地释放细胞内的内容物。另外，应该选择Z佳的裂解缓冲液以促进蛋白质的正确溶解并防止蛋白水解降解，从而获得大量的目标蛋白质。

样品制备的原则

•尽可能采取简单方法，避免蛋白丢失；

•尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解；

•细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶YZ剂防止蛋白降解；

•提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性；

•防止发生人为的蛋白质样品化学修饰（例如加入尿素不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白）；

•尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白；

•样品裂解液新鲜配置，并分装冻存于-80℃。勿反复冻融；

•制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。

蛋白样品的类型

可溶性蛋白：

•培养细胞中可溶性蛋白，包括：细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。

•自然宿主细胞中可溶性蛋白，包括：微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。

不溶性蛋白：

•含包涵体的不溶性蛋白

•膜相关蛋白和难溶性蛋白（非重组蛋白）

蛋白样品制备的流程

•组织、细胞或菌体的破碎和裂解

•沉淀溶液中蛋白

•清除杂质

•蛋白浓缩、纯化

组织或细胞破碎和裂解

为了全面分析细胞内的蛋白，需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解，其方法取决于蛋白样品的来源。同时，因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来，从而导致蛋白降解，影响后续实验结果，因此需要加入蛋白酶YZ剂进行保护。

破碎裂解的方法

温和破碎裂解法（针对组分单一或者分析某一特定组分）：

•渗透裂解（血细胞、组织培养细胞）：将细胞悬浮于渗透溶液中，细胞因肿胀而释放细胞内容物。

•冻融裂解（细菌细胞、组织培养细胞）：反复冻融裂解细胞，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度ZG引起肿胀，使细胞结构破碎。

•裂解液裂解（组织、培养细胞）：含有去污剂的裂解液处理组织或细胞，使细胞膜破碎，细胞内容物释放出来。

•酶裂解（植物、细菌、真菌细胞）：利用酶裂解含有细胞壁的细胞。

•剧烈破碎裂解法（难于破碎细胞：固体组织、坚硬细胞壁）：

•超声裂解（悬浮细胞）：利用超声波产生的切应力来裂解细胞，超声时应在冰上间歇进行。

•弗氏细胞压碎器裂解（含有细胞壁的细胞）：细胞悬液置于高压下QL挤出小孔，压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。

•机械匀浆裂解（固体组织、细胞悬液）：将组织剪成小块，利用匀浆器在加蛋白酶YZ剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。

•研磨法（固定组织、微生物）：样品冻存在液氮中，利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。

玻璃珠匀浆裂解（含有细胞壁的细胞）：利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁，从而释放细胞的内容物。

裂解液一般组成

•缓冲液（Tris-HCl）：提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。

•去污剂（表面活性剂）：破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。

•蛋白酶YZ剂：YZ蛋白酶的活性，防止蛋白被水解。

•磷酸酶YZ剂：YZ磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化。

•还原剂：二硫键断裂和蛋白质变性

•其它：NaCl，促进细胞膜破裂使蛋白溶解。

常见裂解液成份一览表

蛋白酶YZ剂的类型

常用的蛋白酶YZ剂：

丝氨酸蛋白酶YZ剂：PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin（抑肽酶）, Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）。

天冬氨酸蛋白酶YZ剂：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物。

巯基蛋白酶YZ剂：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺。

金属蛋白酶YZ剂（金属离子螯合剂）：EDTA，EGTA，塔罗肽。

（磷酸酶YZ剂：NaF、激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠。）

^{常见的蛋白酶YZ剂一览表}

参考文献：

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.

期刊对Western Blot数据要求：

1. 内参和目的蛋白在同一张印迹膜上；

2. zuihao选择膜染色进行总蛋白归一化；

3. 如果使用看家蛋白，需要提供看家蛋白表达稳定并且不受实验条件影响的证据；

4. 成像方法的线性范围需要提供。

看家蛋白一般常用于内参质控，整张膜上的weiyi质控标准，但是看家蛋白一般表达量比较高，可能与目的蛋白不在一个线性范围内，影响定量；并且看家蛋白证明在多种实验条件下是会发生变化，例如：细胞融合，疾病和药物ZL等等，影响定量jingzhun性。

总蛋白质控直接在膜上检测总蛋白，变异性小，误差小，动态范围更宽，使用整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化，而不是单一的条带，例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推荐使用总蛋白进行归一化。

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做Western Blot的小伙伴，是不是还在为归一化方法而纠结呢？今天小编就和大家汇总一下看家蛋白和总蛋白归一化的方法。

看家蛋白归一化

使用看家蛋白的缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。如使用看家蛋白进行标准化，必须先花费时间和精力来验证内参的选择。

使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高，如果样品中的看家蛋白表达非常高，这会限制在凝胶上加载的样品量，如果感兴趣的蛋白不是同样的表达丰度，那这两种蛋白质就不在同一线性检测范围内。

如果您正在进行多重蛋白印迹，例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式，则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。

检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下，看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同，因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。当实验在同一印迹上检查多种目的蛋白时，这就变得越来越困难。

总蛋白归一化

使用总蛋白归一化，是直接在膜上检测总蛋白，并且该值在归一化时用作分母。总蛋白染色提供更宽的动态范围，并且表现出比看家蛋白更低的可变性和更准确的定量数据。

与使用看家蛋白相比，图像采集后的分析工作流程基本不变; 整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化，而不是单一的条带。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊会推荐使用总蛋白归一化方法。

使用总蛋白染色剂对膜进行染色提供了质控优势，可以验证转印是否完全。

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做Western Blot的小伙伴，你是不是还在那里熬夜赶实验？是不是还在纠结今天的结果怎么和昨天的差异这么大？是不是在为选择哪种检测方法而烦恼？在为实验的重复性而抓狂？今天小编就和大家聊一下Western Blot中遇到的问题以及应对方法。

归一化问题：

做Western Blot经常需要对蛋白进行归一化，经典的归一化方法是看家蛋白归一化，看家蛋白需要选择在不同样品间稳定表达的蛋白；其次表达丰度也需要筛选，如果丰度过高，目的蛋白丰度与看家蛋白差异过大，那两者检测定量时就不在一个线性范围。这样的筛选过程非常耗时耗力。即使筛选到合适的看家蛋白，对其归一化的过程也需要多次重复调节才可以。

检测灵敏度问题：

小编做Western Blot检测时，由于目的蛋白含量低经常曝光不出来，同时老仪器检测灵敏度不够高，只能不断调整实验，提高上样量，再反复进行摸索，做Western 做到怀疑人生。

蛋白定量重复性问题：

Western Blot检测时，化学发光依赖酶活性和底物浓度，发光信号不稳定，因此定量时容易出现误差，重复性相对较差，也只能不断实验来进行调整和验证。

多个目的蛋白检测问题：

Western Blot检测时，有时需要对多个蛋白进行检测，这时的实验就会变的繁琐，需要对每一个蛋白进行表达检测，剪膜，剥离膜经常要做，但是经过这些步骤又会影响定量的JZ性，小编也很为难。

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应对均一化问题，已有众多期刊建议采用总蛋白均一化，总蛋白均一化能够更加真实的反应目的蛋白表达量的变化，同时也无需繁琐的筛选看家蛋白、调整蛋白上样，只需对总蛋白进行染色和调整，Azure提供总蛋白归一化试剂和相应的AzureSpot分析软件，轻松搞定蛋白均一化问题 。

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应对重复性问题，荧光检测方法与传统的化学发光不同，荧光检测方法不依赖酶活性和底物，二抗标记荧光基团，信号强度和上样量成线性关系，信号持久，可以得到更好的重复性结果，实验可以快速完成。

应对多种蛋白检测问题，荧光检测的一个好处是，无需剥离和重孵育，即可在一张印迹膜上进行多种蛋白的检测，减少蛋白变化的误差，实现jingzhun定量。

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无需再为Western实验所累

做Western Blot的小伙伴，是不是还在为选择何种归一化方法而纠结，看家蛋白还是总蛋白？期刊都推荐总蛋白了，那看家蛋白数据还能用吗？看家蛋白有哪些优点和挑战，需要注意什么？如何选择看家蛋白呢？如选择总蛋白归一化，用什么总蛋白试剂进行归一化，如何进行归一化，优点和挑战是什么？

本周邀请Azure Biosystems产品应用专家刘楚珠给正在迷茫中的小伙伴解惑。

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