“沃”的实验 | 20+动物行为学实验方法上新，助你高效科研！

动物行为学实验可以客观性、科学性评价动物的沟通行为、社交行为、学习行为和探索行为等，它可以帮助科研人员探索认知、情绪和运动等复杂的生命现象，将其实验结果类比和推演到人，研究其行为信息的生理和病理意义。但在实验过程中，总会遇到一些大大小小的问题

• 动物行为学实验种类很多，不知道用哪种研究手段？

• 做旷场、高架十字迷宫等实验时，不清楚有哪些注意事项？

• 在做行为学实验数据分析时，哪些数据有用、如何处理数据来支撑自己的研究？

“沃”的实验

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第四期内容：

实验动物行为评估

带你get动物行为学实验的研究方法

「“沃”的实验」——全网最全的生命科学研究线上学习平台第四期，为大家分享实验动物行为评估方法，囊括学习记忆检测、运动检测、抑郁检测、焦虑检测、疼痛检测和行为学分析方法，3位老师线上为你详解超20种动物行为学实验方法，助你轻松完成动物行为学实验，从而提高研究效率与质量。

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►学习记忆检测

• 奖赏相关行为学实验

• 自发活动相关行为学实验

• 惩罚相关行为学实验

►运动检测

• 损伤评估行为学实验

• 耐力评估行为学实验

• 协调评估行为学实验

► 抑郁检测

• 习得性无助实验介绍

• 悬尾实验介绍

• 强迫游泳实验介绍

• 糖水偏好实验介绍

• 旷场实验介绍

• 新奇物体探索实验介绍

• 新奇抑制摄食实验介绍

►焦虑检测

• 高架十字迷宫实验介绍

• O迷宫实验介绍

• 黑白箱实验介绍

• 饮水焦虑实验介绍

• 旷场实验介绍

• 新奇抑制摄食实验介绍

► 疼痛检测

• 疼痛分类及神经通路

• 机械刺痛检测方法

• 热刺痛检测方法

• 自发疼痛检测方法

►行为学分析方法

以西班牙Panlab公司的行为学视频记录分析软件Smart v3.0为例，介绍Smart v3.0软件分析旷场实验视频的操作过程，以及演示Smart v3.0软件的特色功能

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下期内容预告：

神经信号研究-调控与检测方法

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涵盖科研基础知识、实验技能、经验总结

囊括视频课程、实验手册、SOP流程图……

“沃”的实验线上学习平台将陆续上线，包含常见疾病动物模型、实验动物手术操作、实验动物行为评估、神经信号研究、细胞与分子研究……陪你走过整个学期，一站式助你提升科研技能

在做基础研究时加入动物实验不仅会使研究工作更完善，也会提高投稿的命中率，但是想把实验做成功却不是件容易的事儿，因为在动物造模中总遇到各种难题：

• 搞不清动物建模标准化的流程，做起实验磕磕绊绊

• 造模需要注意的细节多，反复摸索十几遍才造模成功

• 明明按照文献中的实验方法造模，却还老是不成功

“沃”的实验

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第二期内容：

常见疾病动物模型——构建方法系列2

帮助大家解决造模中遇到的难题

“沃”的实验——全网最全的生命科学研究线上学习平台第二期内容，为大家分享常见疾病动物模型构建方法，涵盖8大视频课程+2大实验手册+3大建模的标准操作流程。

5位老师线上为你讲解不同动物模型的背景、造模方法等内容，理论结合实践，希望能给大家的动物建模带来更多新思路和新灵感。

  8大视频课程

  2大实验手册

  3大建模的标准操作流程

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下期内容预告：

 实验动物手术操作-手术方法 

背景

1930年，Tolman 和 Honzik 应用14个单元Ｔ型迷宫，研究大鼠的潜伏学习（Latent Learning）。随着研究深入，多单元迷宫演变为目前应用的Ｔ迷宫。1939年，Dennis首次定义了大鼠在Ｔ迷宫中的自发交替（Spontaneous Alternation）行为，认为大鼠能够对探索过的臂产生内起YZ（Internal Inhibition），而进入没有探索过的臂，从而增加发现食物的机会。

原理

T/Y迷宫是一种评价空间记忆能力的行为实验方法，主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆和参考记忆的测试。在本实验中，工作记忆主要指短期记忆，而参考记忆主要指长期记忆。工作记忆能力下降，可出现空间定位困难等症状，参考记忆能力下降可出现新知识学习能力下降等症状。实验过程中，动物对目标臂的选择基于动物记住上次探索过的目标臂，以及对整体实验流程的熟悉程度；可以通过不同的实验方法来测试动物工作记忆和参考记忆的完整情况。

实验材料

T迷宫、Y迷宫、Smart 3.0

实验方法

01.自发连续交替选择实验

此实验为运用T/Y迷宫进行的最简单最基础的行为学测试，主要用于研究动物空间工作记忆的完整程度。优点是实验周期短，仅一天即可完成全部实验。

• 时间

每次实验时间不高于2分钟，每只动物试验连续重复10次。

• 适应期

实验开始前（自己繁育小鼠 Handle 3天，外购动物 Handle 7天），每天抓取、轻抚动物，让其熟悉实验人员手，在实验过程中不会处于应激状态。

• 方法

关闭主臂门闸，将动物放在主臂10秒，打开主臂门闸开始计时，待动物四肢全部进入一个目标臂后，结束计时， 将动物放回主臂，关闭主臂门闸，进行下一轮实验；2分钟内没有进入任何臂，记录实验失败，进行取出放回操作，进行下一轮实验。

• 记录数据

（1）进入左右臂的潜伏期（从主臂进入左右臂所需的时间），每次进入的臂；

（2）潜伏期主要用于判断动物对此实验的积极性；

（3）动物连续进入不同臂N次（N≥3），记为N-2次成功；

（4）实际成功次数/ZD成功次数 计算出动物实验成功率，以此判断动物自发连续交替选择的程度 百分比越高，说明动物工作记忆能力越强。

• 注意事项

（1）此实验为连续实验，应完成一只动物试验后再开展另一只动物的实验；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）每只动物测量以及清理时间合计约25分钟，如需对动物进行给药，需要逐只给药，确保药物生效后再进行实验。

02.奖赏交替选择实验（主要运用于T迷宫）

此实验为运用T迷宫进行的较为常规的行为学测试，采用食物奖赏诱导动物完成相关行为，让动物逐渐学会实验规定的迷宫探索方式。主要用于研究动物参考记忆的完整程度。优点在于利用食物形成奖赏机制，动物会更配合完成整个实验。

适应训练

• 时间

实验第 一天和第二天，每日4次，每次间隔大于10分钟。

• 方法

将多只动物放入迷宫3分钟，让动物进行自行探索。

• 注意事项

实验前动物需要限食，动物体重降低至实验前85%-90%后方可进行实验，若动物表现出不喜好探索的现象，可以利用少量食物诱导探索。

强迫选择训练

• 时间

实验第三至六天，每日6次。

• 方法

将动物放入主臂，同时在左右臂随机一臂中放入少量食丸（如4粒），关闭另一臂的进入通道，使动物被迫完成摄食强化。

• 记录数据

主臂滞留时间。

• 注意事项

（1）每只动物每次实验应间隔大于10分钟；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）训练左臂与右臂获得食丸数量，次数应保持一致。

测试

• 时间

实验第七天开始，至对照组动物平均正确率达到85%结束。每天重复6次。

• 方法

（1）强迫动物从主壁进入一侧实验臂，获得更少量的食丸奖励（如2粒）；

（2）获得食丸后立即将动物移回主臂（总时间应小于5秒），限制活动10秒；

（3）同时开放两侧实验臂，动物将四肢移动进一个实验臂视为一次选择，结束一次实验：

① 若进入DY步进入过的臂，则无奖励，限制活动10s，记录一次错误选择，

② 若进入DY步未进入过的臂，则给与少量奖励，记录一次正确选择。

• 记录数据

正确选择，错误选择次数，主臂滞留时间：

（1）主壁滞留时间主要用于判断动物对此实验的积极性；

（2）根据正确选择，错误选择次数计算出每天的平均正确率；

（3）平均正确率提升越快，说明动物参考记忆能力越强。

• 注意事项

（1）每只动物每次实验应间隔大于10分钟；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）如需对动物进行给药，则仅在此测试阶段进行给药。

03.空间识别（主要运用于Y迷宫）

此实验为运用Y迷宫进行的较为常规的行为学测试，是根据啮齿类动物天生对未知事物有强烈的好奇心以及探索欲望的原理进行的。优点在于可以同时对动物的参考记忆和工作记忆进行研究，实验方式简单。

• 时间

（1）测试工作记忆，探索期与测试期建议间隔2小时；

（2）测试参考记忆，探索期可设置1-2天，隔天进行测试；

（3）同时测试参考与工作记忆，探索期与测试期间隔2小时，每天重复一次实验，持续进行5-7天。

• 方法

（1）适应期：实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被抓出的环境；

（2）探索期：将迷宫的一个臂封锁，在一个臂远离中间的位置放置动物，让动物在其它两个臂自由探索3分钟；

（3）测试期：将迷宫封锁的臂打开，在与探索期相同的位置放置动物，在让动物自由活动3分钟。

• 数据记录

（1）总活动路程，未开放臂进入潜伏期，每个臂滞留时间及路程，进入每个臂的次数；

（2）总活动路程仅作为参考，排除一些无运动意愿动物的数据；

（3）潜伏期越短，说明动物记忆力越好；

（4）进入未开放臂的时间越久，运动路程越长，进入次数越多说明动物记忆力越强；

（5）同时测试参考与工作记忆时，每次试验中放置动物的位置应保持一致，记录动物在测试期进入另外两个臂的时间比例。正常动物实验初期进入未开放臂的时间比例可达到80%，随着实验时间的增加，比例逐渐降低至50%左右。工作记忆受损的动物在实验开始时进入未开放臂的时间比例就接近50%左右；参考记忆受损的动物进入未开放臂的时间比例则会一直维持在一个较高的水平。

• 注意事项

（1）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（2）如需对动物进行给药，则需要在探索期就进行给药。

04.数据分析

常规方法是采用单因素方差分析（one way-ANOVA）；当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法，P<0.05认为具有统计学显著性差异。

【参考文献】

1. Deacon Robert M J, Rawlins J Nicholas P, T-maze alternation in the rodent.[J]. Nat Protoc,2006 , 1 : 7 - 12. （IF：13.493）（自发交替和奖赏交替）

2.Hughes Robert N,The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory.[J] .Neurosci Biobehav Rev, 2004, 28: 497-505. （IF：8.33）（自发交替与空间识别）

实验动物该怎么选择？

不同脑缺血模型，弄不清对应构建方法？

常用的血流监测技术，你都掌握了吗？

「全线赋能·“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第五期为大家聚焦

《脑缺血模型构建及检测》

从实验动物的选择、不同模型的分类

各个模型的构建方法到血流监测技术

两位老师将进行综合详细的讲解

全面助力你的科研实验研究

直播时间

6月21日（周二）19：00

报名方式

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主题：脑缺血模型构建

• 脑缺血研究背景

• 脑缺血动物模型构建

• 脑缺血模型构建实验仪器

讲师：孙绍强

瑞沃德行业解决方案专家，在膜片钳/钙成像/干细胞诱导方面有着丰富的实验经验，曾参与多项重大研发及自然科学基金项目，曾在Cell Stem Cell 上发表论文，专注于神经疾病，脑缺血及神经退行性疾病模型制备和机制研究，已为上百家客户提供专业的神经疾病整体解决方案。

主题：脑卒中研究中的血流监测技术

• 激光多普勒

• 激光散斑

• 超声多普勒

• 核磁共振成像

• 双光子显微镜

讲师：殷维君

瑞沃德微循环监测解决方案专家，在生理信号监测和血流血氧成像领域拥有丰富的经验，主导动物活体成像解决方案的设计及优化，专注于临床及临床前微循环监测解决方案的构建。

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

Q1：组织剪切的大小有没有具体要求，肿瘤组织一般2-4mm可以吗？

A1：这要根据组织类型去判断，一般会预处理成10mm左右的组织块，太大可能会导致处理不完全，太小可能导致细胞死亡增加，甚至导致样本变稠等。

Q2：细胞活率80%就可以了吗，看到一些资料写的都要90%以上。

A2：这个需要根据下游实验的需求灵活调整，如果样本存活率不能达到要求的话，除了优化实验条件以外，还可以通过一些死细胞去除的试剂来优化已获得的样本。

Q3：低温解离细胞与常规的37度制备单细胞优势分别是什么？区别是什么？

A3：37℃条件下进行组织解离，由于细胞转录活跃，因此解离过程中基因表达可能会发生改变，可能会干扰应激反应相关基因表达，所以在进行snRNA-seq时可以通过使用冷活性酶释放细胞核，同时一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用低温解离的分离方式，但是低温条件对一些质密难解离的组织的处理效率可能会降低。

另外，温度对不同细胞种类也有一定影响，比如在进行脑组织解离时，热解离可能会影响神经元和星形胶质细胞的获取，但是会大量富集小胶质细胞，所以在进行组织解离时，根据获得目的细胞的需求要灵活调整解离方案。

Q4：裂红处理有什么注意事项吗？

A4：如果直径6-8μm的细胞占比较高，且有核率偏低，这表明红细胞含量可能较多，需要进行红细胞裂解，如果红细胞裂解依然不干净，不建议增大裂解体系，建议适当延长裂红时间，或适当增加裂红次数。

Q5：流式染色时间及温度如何选择？

A5：染色本身取决于抗体抗原之间的结合能力，染色时间和温度，受限于抗体浓度，一般根据选择抗体的说明书推荐的浓度和孵育时间、温度选择。我的实践经验：当不清楚说明书的情况，我会选择室温染色12-15min（取决于抗体浓度微调），或4度冰上30min。注意染色时间尽量不要让细胞破损，否则死细胞碎片会影响流式结果。此外细胞消化完毕后应该尽快染色处理，特别是一些凋亡染色、胞内酶染色为保持细胞物质活性，应尽快染色。

Q6：请问流式细胞实验中单抗进行荧光需要什么样的对照？

A6：关于对照设置，这个比较复杂，一般我们是选择同型对照作为阴性对照组，得到的结果往往是比较好的。所谓的同型对照就是同种属同亚型、相同荧光标记物、使用剂量和浓度相同，且属于非特异性结合的抗体为同型对照组。通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 

还有一类就是最常见的纯阴性对照，检测细胞群不进行任何抗体处理，直接进行流式检测，这就是简单消除细胞和溶剂本身的影响，这种方法的好处是节约抗体，毕竟抗体很贵。

Q7：如何减少补偿的干扰？

A7：补偿干扰往往是多激光的流式仪器才会发生一定干扰情况，此时，可以根据抗体公司提供的染料搭配方案选择比较好，也就是发射光谱的波长峰尽量不重叠的染料，这样补偿干扰会尽量消除。因此，往往需要查看染料的波长范围，此外，对于4色以上的多色标记情况，一般不常见，此时往往染料的波长范围难以避免的重叠，这时候，推荐使用抗体公司推荐的配色方案，尽量避免发射光谱的重叠。此外很多流式仪器配套软件都带一定算法对补偿进行修正，可以适当修正这个影响。

Q8：细胞自发荧光如何解决？

A8：细胞自发荧光往往是细胞内物质带有荧光，植物细胞因为叶绿素原因会自带一定荧光，然后一些药物处理下，药物本身带有发色基团，也可能自荧光，此时，纯阴性对照的设置可以补偿一定的情况。然后就是染料的选择情况，染料荧光波长范围避免与细胞自发荧光的波长的重叠，这样会比较好一些。我之前做药物的细胞凋亡实验时候，考虑到药物的情况，就没有使用常见的凋亡检测的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。尽量设置纯阴性对照、有条件做下同型对照，往往可以在数据处理时候适当减少部分因素的影响。这样流式的结果会更好。

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来看看这是实验中的你吗？

抑郁造模实验中，小鼠总是伤痕累累达不到使用标准，上网也查不到原因，太心累了

到信号采集这步，突然发现小鼠的电极掉了，数据采集不到，去网上又找不到完整的资料

迷宫类行为学实验种类太多，找资料花了好长时间，要是所有的迷宫实验的资料在一起就好了......

查找科研资源如大海捞针，耗时耗力

效率提不上去，科研工作都耽误了

自从“沃”的实验 | 实验方法实战教程

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“沃”的实验科研资源分享平台首批内容上线，我们为大家分享常见疾病动物模型——构建方法的视频课程+3大实验手册+2大实验解决方案流程图（SOP），涵盖8大动物模型构建课程，4位老师全面讲解每个造模的背景、方法等内容，全面汇总造模技术，助力大家系统性提升科研能力。

• 第一课：阿尔茨海默症模型

• 第二课：帕金森病模型

• 第三课：脑缺血模型

• 第四课：抑郁模型

• 第五课：焦虑模型

• 第六课：创伤后应激障碍模型

• 第七课：自闭症谱系障碍模型

• 第八课：成瘾模型

• 代谢类疾病研究手术与造模手册大全

• 呼吸系统疾病研究手术与造模手册大全

• 神经系统研究手术与造模手册大全

• 动物麻醉解决方案

• 给药手术解决方案

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