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动物行为学实验可以客观性、科学性评价动物的沟通行为、社交行为、学习行为和探索行为等，它可以帮助科研人员探索认知、情绪和运动等复杂的生命现象，将其实验结果类比和推演到人，研究其行为信息的生理和病理意义。但在实验过程中，总会遇到一些大大小小的问题

• 动物行为学实验种类很多，不知道用哪种研究手段？

• 做旷场、高架十字迷宫等实验时，不清楚有哪些注意事项？

• 在做行为学实验数据分析时，哪些数据有用、如何处理数据来支撑自己的研究？

“沃”的实验

全网最全的生命科学研究线上学习平台

第四期内容：

实验动物行为评估

带你get动物行为学实验的研究方法

「“沃”的实验」——全网最全的生命科学研究线上学习平台第四期，为大家分享实验动物行为评估方法，囊括学习记忆检测、运动检测、抑郁检测、焦虑检测、疼痛检测和行为学分析方法，3位老师线上为你详解超20种动物行为学实验方法，助你轻松完成动物行为学实验，从而提高研究效率与质量。

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►学习记忆检测

• 奖赏相关行为学实验

• 自发活动相关行为学实验

• 惩罚相关行为学实验

►运动检测

• 损伤评估行为学实验

• 耐力评估行为学实验

• 协调评估行为学实验

► 抑郁检测

• 习得性无助实验介绍

• 悬尾实验介绍

• 强迫游泳实验介绍

• 糖水偏好实验介绍

• 旷场实验介绍

• 新奇物体探索实验介绍

• 新奇抑制摄食实验介绍

►焦虑检测

• 高架十字迷宫实验介绍

• O迷宫实验介绍

• 黑白箱实验介绍

• 饮水焦虑实验介绍

• 旷场实验介绍

• 新奇抑制摄食实验介绍

► 疼痛检测

• 疼痛分类及神经通路

• 机械刺痛检测方法

• 热刺痛检测方法

• 自发疼痛检测方法

►行为学分析方法

以西班牙Panlab公司的行为学视频记录分析软件Smart v3.0为例，介绍Smart v3.0软件分析旷场实验视频的操作过程，以及演示Smart v3.0软件的特色功能

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下期内容预告：

神经信号研究-调控与检测方法

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涵盖科研基础知识、实验技能、经验总结

囊括视频课程、实验手册、SOP流程图……

“沃”的实验线上学习平台将陆续上线，包含常见疾病动物模型、实验动物手术操作、实验动物行为评估、神经信号研究、细胞与分子研究……陪你走过整个学期，一站式助你提升科研技能

作为一线的科研人，往往都要做动物实验，有时高分科研paper也离不开动物实验的支撑。你是否还在为动物实验手术操作而犯愁：

• 给药、埋置等操作比较繁杂，稍不留意就会功亏一篑？

• 只会皮下注射，其他腹腔、鞘内、肌肉注射给药技术都没操作过？

• 颅脑损伤实验，老鼠颅骨不好固定？

• 查阅大量文献，实际手术操作还是不会做？

• 没人指导，实验一拖再拖？

「“沃”的实验」——全网最全的生命科学研究线上学习平台第三期，为大家分享实验动物手术操作方法，涵盖12种手术操作技术/4大手术操作实验/10大视频课程，带你轻松熟悉注射给药、手术埋置、颅脑/脊髓损伤和缓释泵植入等实验，加速你的实验进程，助你paper连连。

>动物注射给药技术

• 腹腔注射

• 皮下注射

• 肌肉注射

• 尾静脉注射

• 鞘内注射

>动物手术埋植实验

• 立体定位注射/插针埋置实验操作

• 电极埋植手术操作

• 给药套管埋植手术操作

• 脑组织移除及透镜植入实验操作

 >颅脑/脊髓损伤实验 

• 颅脑损伤实验操作

• 脊髓横断实验操作

>缓释泵植入实验

• 植入式缓释泵概述

• 缓释泵植入实验操作

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学习与记忆

学习是高等生物接受外界环境变化获得新行为和经验的过程，常见的学习形式有非联合型学习和联合型学习两种。人或动物受到一次或多次单一刺激后形成的、并不需要将两个以上刺激或刺激与反应之间形成明确联系的过程，如习惯化（习以为常），称为非联合型学习；人或动物受到一系列事物刺激、且在时间上很靠近地重复发生，ZH在脑内逐渐形成联系，如操作性条件反射，称为联合型学习。

记忆是对学习获得的经验或行为的保持，包括获得、巩固、再现及再巩固四个环节，常见的有程序性记忆与陈述性记忆。程序性记忆即无意识情况下建立的无法用语言描述的记忆，如使用筷子；陈述性记忆指可以用语言描述的关于过去经历或事件的记忆，包括事实、事件、情景以及他们间的相互关系等，如回忆并说出事情经过。

学习与记忆二者是互相联系的神经活动过程，学习过程中必然包含记忆，记忆也总是需要以学习为先决条件。以实验动物为对象，采集并分析动物的行为信息是学习与记忆的常规研究手段之一。例如：利用动物自发活动特性进行研究、通过奖惩等操纵进行研究等。今天我们主要介绍利用动物自发活动进行研究的最常用手段之一：Morris水迷宫中的平台探查实验研究方法（常规的水迷宫实验包括Morris水迷宫、通道式水迷宫等，由于Morris水迷宫最常用，本文主要介绍Morris水迷宫）。后续我们还会介绍：T/Y迷宫、放射性迷宫（八臂迷宫）、物体识别（新物体识别、位置物体识别）、操作性条件反射（斯金纳箱）、穿梭箱、跳台、避暗箱、巴恩斯迷宫等。

实验方法步骤

1.原理

1981年，Morris基于动物厌恶水环境的特性建立了水迷宫方法，实验动物被迫游泳，学习寻找隐藏在水中的平台。通过记录实验动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

2.文献

Partial loss of psychiatric risk gene Mir137 in mice causes repetitive behavior and impairs sociability and learning via increased Pde10a.

3.实验设备

Morris水迷宫、Smart 3.0软件、摄像系统等。

4.实验方法

常用实验分组方法

01、已知品系的记忆缺陷转基因动物模型

(1)对照组：按照实际实验需求选定（分类一：工具鼠的空载鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分类二：同笼阴性鼠、转基因品系背景鼠等）

(2)转基因对照组：不作任何处理的转基因动物

(3)转基因实验组：对转基因动物进行额外处理，如给药，注射病毒等

02、定向基因编辑待验证的转基因动物

(1)对照组：按照实际实验需求选定。（分类一：工具鼠的空载鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分类二：同笼阴性鼠、转基因品系背景鼠等）

(2)转基因组：不作任何处理的转基因动物

03、验证药物造模效果-学习记忆变强/变弱

(1)对照组：不作任何处理的动物

(2)实验组：使用造模药物使动物学习记忆能力变化的动物

04、验证受试药物对造模药物的恢复效果

(1)对照组：不作任何处理的动物

(2)药物造模组：使用造模药物使动物出现记忆力问题的动物

(3)实验组：对药物造模组动物使用受试药物恢复的动物

*所有实验动物均进行同样的实验流程，在实验开始就应对需要给药的动物进行给药

适应阶段

实验开始前3-7天（自己繁育小鼠 Handle 3天，外购动物 Handle 7天），每天抓取、轻抚动物，让其熟悉实验人员手，在实验过程中不会处于应激状态。

学习阶段

01、旗帜标记学习(1)实验设置

• 在迷宫臂交叉垂直的四个方向的水面上方分别放置一个显眼（与水面，窗帘的颜色不同）的标志物（如圆形，方形，五角星，三角形等）可以贴在桶臂上，也可以贴在帘子上（需避免帘子在实验过程中晃动），或者房间墙壁上（此时需要没有帘子）

• 将水面按照标记物的位置分为4个象限，并将平台放置于一个象限的ZX

• 将平台置于水下1-2厘米深（加入染料后，根据动物游泳过程中水面波动后，水平台不会露出水面即可）。不宜太深，平台过深会导致动物到达平台后仍然继续游走

• 在平台上放置一个高于水面的标记物，使动物可以通过标记物确认平台位置

(2)时间

根据动物学习记忆水平，可设置0-6天的学习时间

(3)方法

将动物分别从不同象限放入水中，让动物自由活动寻找平台。

• 动物找到平台：记录时间，让动物在平台停留30s，观察周围环境

• 动物未找到平台：动物自由活动1-2min（实验中保持一致，推荐1min）后， 将动物引导至平台所在处，并停留30s，让动物观察周围环境

每只动物每天分别随机从4个象限各进行一次实验，两次实验需要间隔至少2-3min（推荐2min），让动物补充体力。（方法一：两只动物同时开展实验，交替进行学习，即动物A进行Trial1，接下来动物B进行Trial1，动物A进行Trial2依次进行实验。方法二：单只动物进行4个Trial实验后，再开展另外一只动物训练实验。）

(4)记录数据

第  一次到达平台的时间（潜伏期），总活动轨迹、距离。

• 总活动轨迹用于判断动物是否有不利于实验结果的行为习惯（如绕圈，跳跃等），必要时以此剔除动物

• 总活动距离仅做动物活跃程度参考，受潜伏期以及动物活跃程度影响

• 潜伏期越短说明动物已经学会找到平台这一行为，学习能力越强

02、平台学习

(1)实验设置：取下平台上高于水面的标记物，其余保持不变

(2)时间：根据动物学习记忆水平，可设置4-7天的学习时间

(3)方法：

将动物分别从不同象限放入水中，让动物自由活动寻找平台。

• 动物找到平台：记录时间，让动物在平台停留30s，观察周围环境

• 动物未找到平台：动物自由活动1-2min（实验中保持一致，推荐1min）后， 将动物引导至平台所在处，并停留30s，让动物观察周围环境

每只动物每天分别随机从4个象限各进行一次实验，两次实验需要间隔至少2-3min（推荐2min），让动物补充体力

(4)记录数据：第  一次到达平台的时间（潜伏期），总活动轨迹、距离

• 总活动轨迹用于判断动物是否有不良行为习惯（如绕圈，跳跃等），必要时以此剔除动物

• 总活动距离仅做动物活跃程度参考，受潜伏期以及动物活跃程度影响

• 潜伏期越短说明动物已经学会找到平台这一行为，学习能力越强

测试阶段

01、实验设置

去除水中的平台，其余保持不变

02、时间

平台学习结束后一天

03、方法

将动物在指定位置放入水迷宫中，让动物在水中自由活动1-2min（推荐1min，与学习阶段测试时间相同）

04、记录数据

主要包括：平台区域经过次数、平台区域停留时间、总活动轨迹与距离、不同象限活动时间、距离。

(1)经过平台区域次数为主要指标，经过次数越多，说明动物记忆越好

(2)平台区域停留时间作为经过平台次数的参考，部分动物可能会在平台区域停留，导致经过平台区域次数较少

(3)总活动轨迹可以作为实验结果进行展示

(4)当经过平台次数，停留时间无显著差异时，考虑分析平台所在象限的活动时间及距离是否有差异，部分动物可能对平台具体位置记忆不是特别清楚，但是会在平台附近区域反复移动

5.数据分析

1、不同时期分析的数据类型不同

2、采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法

3、P<0.05认为具有统计学显著性差异

6.注意事项

（1）实验时，建议将水温维持在21℃-23℃范围内。水温过低或过高均容易导致动物产生应激反应。

（2）实验时间周期设置应保证对照组对照组的动物学会的最短时间为标准，实验周期过长会让学会寻找平台的动物产生厌倦感，从而影响实验结果。

（3）每次实验结束后，需要将动物毛发擦干，避免动物受凉死亡。

（4）实验中需要在水中加入不易变质的染料，不仅可以增加水面与动物颜色的对比度，也可以防止动物透过透明的水看到平台。黑鼠棕鼠推荐使用钛白  粉做为染料（购买链接→）；白鼠推荐使用食用黑色素作为染料（购买链接→）。

另外还可选择使用透明浮珠，其有反射少、蒸发少等特点，但是阻力大，会导致小鼠游泳非常累，因此不推荐。

（5）实验进行过程中不要进行换水。虽然水池中会存在很多动物排泄物导致异味产生，但换水操作可能会导致动物认为进入了一个新的环境而影响实验结果。

（6）加入的染料易在水中沉降，每半天进行实验前应对水进行搅拌，使染料重新分布均匀。

（7）实验过程中每天都会有水的损耗，导致平台深度越来越浅。建议实验开始前确定一个标准水位，后续每天进行实验前，对迷宫进行补水。

（8）实验过程中应尽可能保持安静，避免声音影响动物对方向的判断。

（9）实验人员将鼠放入水迷宫后，应尽快离开动物视线区域以及视频记录区域，避免被动物当做标记物，或被视频记录识别为实验动物。

（10）固定时间点开展实验。由于动物节律问题，在一天不同的时间段进行实验会导致实验结果不同。建议实验过程中，不同实验组的动物逐只或逐2只进行实验，可以获得更为准确的实验结果。

在做基础研究时加入动物实验不仅会使研究工作更完善，也会提高投稿的命中率，但是想把实验做成功却不是件容易的事儿，因为在动物造模中总遇到各种难题：

• 搞不清动物建模标准化的流程，做起实验磕磕绊绊

• 造模需要注意的细节多，反复摸索十几遍才造模成功

• 明明按照文献中的实验方法造模，却还老是不成功

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第二期内容：

常见疾病动物模型——构建方法系列2

帮助大家解决造模中遇到的难题

“沃”的实验——全网最全的生命科学研究线上学习平台第二期内容，为大家分享常见疾病动物模型构建方法，涵盖8大视频课程+2大实验手册+3大建模的标准操作流程。

5位老师线上为你讲解不同动物模型的背景、造模方法等内容，理论结合实践，希望能给大家的动物建模带来更多新思路和新灵感。

  8大视频课程

  2大实验手册

  3大建模的标准操作流程

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下期内容预告：

 实验动物手术操作-手术方法 

背景

1930年，Tolman 和 Honzik 应用14个单元Ｔ型迷宫，研究大鼠的潜伏学习（Latent Learning）。随着研究深入，多单元迷宫演变为目前应用的Ｔ迷宫。1939年，Dennis首次定义了大鼠在Ｔ迷宫中的自发交替（Spontaneous Alternation）行为，认为大鼠能够对探索过的臂产生内起YZ（Internal Inhibition），而进入没有探索过的臂，从而增加发现食物的机会。

原理

T/Y迷宫是一种评价空间记忆能力的行为实验方法，主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆和参考记忆的测试。在本实验中，工作记忆主要指短期记忆，而参考记忆主要指长期记忆。工作记忆能力下降，可出现空间定位困难等症状，参考记忆能力下降可出现新知识学习能力下降等症状。实验过程中，动物对目标臂的选择基于动物记住上次探索过的目标臂，以及对整体实验流程的熟悉程度；可以通过不同的实验方法来测试动物工作记忆和参考记忆的完整情况。

实验材料

T迷宫、Y迷宫、Smart 3.0

实验方法

01.自发连续交替选择实验

此实验为运用T/Y迷宫进行的最简单最基础的行为学测试，主要用于研究动物空间工作记忆的完整程度。优点是实验周期短，仅一天即可完成全部实验。

• 时间

每次实验时间不高于2分钟，每只动物试验连续重复10次。

• 适应期

实验开始前（自己繁育小鼠 Handle 3天，外购动物 Handle 7天），每天抓取、轻抚动物，让其熟悉实验人员手，在实验过程中不会处于应激状态。

• 方法

关闭主臂门闸，将动物放在主臂10秒，打开主臂门闸开始计时，待动物四肢全部进入一个目标臂后，结束计时， 将动物放回主臂，关闭主臂门闸，进行下一轮实验；2分钟内没有进入任何臂，记录实验失败，进行取出放回操作，进行下一轮实验。

• 记录数据

（1）进入左右臂的潜伏期（从主臂进入左右臂所需的时间），每次进入的臂；

（2）潜伏期主要用于判断动物对此实验的积极性；

（3）动物连续进入不同臂N次（N≥3），记为N-2次成功；

（4）实际成功次数/ZD成功次数 计算出动物实验成功率，以此判断动物自发连续交替选择的程度 百分比越高，说明动物工作记忆能力越强。

• 注意事项

（1）此实验为连续实验，应完成一只动物试验后再开展另一只动物的实验；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）每只动物测量以及清理时间合计约25分钟，如需对动物进行给药，需要逐只给药，确保药物生效后再进行实验。

02.奖赏交替选择实验（主要运用于T迷宫）

此实验为运用T迷宫进行的较为常规的行为学测试，采用食物奖赏诱导动物完成相关行为，让动物逐渐学会实验规定的迷宫探索方式。主要用于研究动物参考记忆的完整程度。优点在于利用食物形成奖赏机制，动物会更配合完成整个实验。

适应训练

• 时间

实验第 一天和第二天，每日4次，每次间隔大于10分钟。

• 方法

将多只动物放入迷宫3分钟，让动物进行自行探索。

• 注意事项

实验前动物需要限食，动物体重降低至实验前85%-90%后方可进行实验，若动物表现出不喜好探索的现象，可以利用少量食物诱导探索。

强迫选择训练

• 时间

实验第三至六天，每日6次。

• 方法

将动物放入主臂，同时在左右臂随机一臂中放入少量食丸（如4粒），关闭另一臂的进入通道，使动物被迫完成摄食强化。

• 记录数据

主臂滞留时间。

• 注意事项

（1）每只动物每次实验应间隔大于10分钟；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）训练左臂与右臂获得食丸数量，次数应保持一致。

测试

• 时间

实验第七天开始，至对照组动物平均正确率达到85%结束。每天重复6次。

• 方法

（1）强迫动物从主壁进入一侧实验臂，获得更少量的食丸奖励（如2粒）；

（2）获得食丸后立即将动物移回主臂（总时间应小于5秒），限制活动10秒；

（3）同时开放两侧实验臂，动物将四肢移动进一个实验臂视为一次选择，结束一次实验：

① 若进入DY步进入过的臂，则无奖励，限制活动10s，记录一次错误选择，

② 若进入DY步未进入过的臂，则给与少量奖励，记录一次正确选择。

• 记录数据

正确选择，错误选择次数，主臂滞留时间：

（1）主壁滞留时间主要用于判断动物对此实验的积极性；

（2）根据正确选择，错误选择次数计算出每天的平均正确率；

（3）平均正确率提升越快，说明动物参考记忆能力越强。

• 注意事项

（1）每只动物每次实验应间隔大于10分钟；

（2）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（3）如需对动物进行给药，则仅在此测试阶段进行给药。

03.空间识别（主要运用于Y迷宫）

此实验为运用Y迷宫进行的较为常规的行为学测试，是根据啮齿类动物天生对未知事物有强烈的好奇心以及探索欲望的原理进行的。优点在于可以同时对动物的参考记忆和工作记忆进行研究，实验方式简单。

• 时间

（1）测试工作记忆，探索期与测试期建议间隔2小时；

（2）测试参考记忆，探索期可设置1-2天，隔天进行测试；

（3）同时测试参考与工作记忆，探索期与测试期间隔2小时，每天重复一次实验，持续进行5-7天。

• 方法

（1）适应期：实验开始前3-7天，每天抓取、轻抚动物，让其适应被抓出的环境；

（2）探索期：将迷宫的一个臂封锁，在一个臂远离中间的位置放置动物，让动物在其它两个臂自由探索3分钟；

（3）测试期：将迷宫封锁的臂打开，在与探索期相同的位置放置动物，在让动物自由活动3分钟。

• 数据记录

（1）总活动路程，未开放臂进入潜伏期，每个臂滞留时间及路程，进入每个臂的次数；

（2）总活动路程仅作为参考，排除一些无运动意愿动物的数据；

（3）潜伏期越短，说明动物记忆力越好；

（4）进入未开放臂的时间越久，运动路程越长，进入次数越多说明动物记忆力越强；

（5）同时测试参考与工作记忆时，每次试验中放置动物的位置应保持一致，记录动物在测试期进入另外两个臂的时间比例。正常动物实验初期进入未开放臂的时间比例可达到80%，随着实验时间的增加，比例逐渐降低至50%左右。工作记忆受损的动物在实验开始时进入未开放臂的时间比例就接近50%左右；参考记忆受损的动物进入未开放臂的时间比例则会一直维持在一个较高的水平。

• 注意事项

（1）每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味；

（2）如需对动物进行给药，则需要在探索期就进行给药。

04.数据分析

常规方法是采用单因素方差分析（one way-ANOVA）；当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法，P<0.05认为具有统计学显著性差异。

【参考文献】

1. Deacon Robert M J, Rawlins J Nicholas P, T-maze alternation in the rodent.[J]. Nat Protoc,2006 , 1 : 7 - 12. （IF：13.493）（自发交替和奖赏交替）

2.Hughes Robert N,The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory.[J] .Neurosci Biobehav Rev, 2004, 28: 497-505. （IF：8.33）（自发交替与空间识别）

自主给药实验

01.准备

◆ Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorIncubation of Cocaine Craving After Intermittent-Access Self-administration: Sex Differences and Estrous Cycle

◆ Materials and Reagents（材料与试剂）实验分组：对照组，自主给药时给生理盐水。实验组，自主给药时给受试药物。

◆ Equipment （仪器设备）
Lafayette斯金纳箱-自主给药系统

02.Principle（原理）

自主给药系统（自身给药实验）是行为药理研究的常用方法，它利用某些药物的正性强化作用，通过一定条件控制，使动物建立起行为与奖赏之间的联系，从而模拟人类药物滥用的一些情况。

1954年，詹姆斯·奥尔兹和皮特·米尔纳ZX认识到脑内存在奖赏系统并运用动物自主给药系统：按压按钮使大鼠接受大脑中的对特定部位短暂的电刺激。

奖赏环路的分类

正性奖赏环路（增大奖赏效应）和负性奖赏环路（YZ奖赏效应），此处主要介绍正反馈自主给药实验。

1、正性奖赏环路

中脑边缘多巴胺（Dopamine，DA）系统是奖赏环路的ZX。该系统主要起源于两个脑区：中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）和黑质致密部（Substantial nigra pars compacta，SNpc）。VTA多巴胺能神经元主要投射到伏隔核（Nucleus Accumbens，NAcc）、内侧前额叶皮层（Medial Prefrontal Cortex）和基底外侧杏仁核（basolateral nucleus of amygdale，）。此外，基底外侧杏仁核的谷氨酸能神经元可以通过 NAcc 间接投射到VTA。内侧前额叶皮层也能投射到VTA，这些脑区共同构成了正性奖赏环路。其中，VTA富含多巴胺能神经元，是调控奖赏功能的主要区域，这就是奖励对动物神经内分泌的作用的体现之一。

2、负性奖赏环路

研究表明LHb接收来自苍白球、下丘脑和前扣带回等脑区的输入，然后投射到VTA的多巴胺能神经元。这些通路共同构成了负性奖赏环路。外侧缰核（lateral habenula，LHb）是负性奖赏环路的主要区域。研究发现，向猴子进行厌恶刺激会强烈激活LHb神经元；用光遗传方法激活大鼠脚内核到LHb的输入会使得大鼠厌恶、逃避所探索的环境。这表明在啮齿类动物和非人灵长类动物中LHb均参与处理和编码厌恶信息，提示我们可通过激活LHb来YZ奖赏效应，从而ZL药物成瘾、YZ动物刻板行为的目的。

03.Procedure （方法步骤）

适应期

1. handle动物3-7天，使动物适应被抓取，不会产生过大的应激反应

学习期

1. 斯金纳箱预设程序，压杆一次给予糖水奖励（比较简单，无需禁食），每个实验周期设为10分钟或压杆20次；

2. 将动物放入斯金纳箱进行学习，每天1次；

3. 动物10分钟内按压压杆20次，且按压后进入食槽获得奖励概率大于85%，稳定重复2天，视为学会压杆；

4. 当有满足分组数量足够多的动物学会压杆操作后（每组额外预留多只动物，后续仍会有淘汰阶段），结束学习期，淘汰没有学会压杆的动物（淘汰动物可以用于其它实验）。

实验期

1. 对所有学会压杆的动物进行静脉埋管；

2. 埋管后重复一天斯金纳箱学习实验，剔除埋管导致压杆行为丧失的动物；

3. 将剩余动物按照实验需要进行分组；

4. 斯金纳箱预设程序 ，压杆一次给予药物注射一定时间，药物依据分组不同而不同。每个实验周期设为10分钟；

5. 将动物放入斯金纳箱中进行实验，每天1次，共计2天。

04.检测数据

实验期动物按压压杆的次数。

正性奖赏环路实验中，对照组一般注射溶剂或者生理盐水等动物不会产生成瘾反应的液体，动物会在实验过程中发生行为消退，两次实验过程中按压压杆次数会减少。若药物对于动物有成瘾作用，则动物会视药物注射为奖励，压杆操作则不会因为消退而导致减少，甚至可能会产生更多次的按压行为。负性奖赏环路实验中，对照组一般注射容易让动物产生成瘾反应的液体，从而动物在实验过程中不易发生行为消退，两次实验过程中压杆次数不会减少，甚至会增多。若受试药物对此有YZ作用，则动物会发生行为消退，两次实验过程中按压压杆次数会减少。

05.数据分析方法

*注意事项

◆ 触鼻和压杆是两种经典斯金纳箱常用响应方式。之所以选择压杆而不是触鼻进行实验，是因为触鼻是动物本来就存在的一种行为，造模相对会比较类似于经典条件反射。

◆ 实验期应对动物食槽进行遮挡，避免动物进入食槽时可能会扯掉给药导管。

◆ 如果需要同时评估药物除了成瘾外的其它功能，如对动物记忆、注意力的作用等，则需使用更为复杂的斯金纳箱应用程序来进行实验，实验周期也会有所延长。若受试药物为兴奋剂类型的药物，动物可能会进入过度亢奋的状态，产生如四处乱跳等亢奋行为，会对压杆操作有一定的影响。此时建议结合视频录制来观察动物状态，确定药物是否有成瘾倾向

糖水偏好实验

01.准备

◆ Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorChemogenetic inhibition of lateral habenula projections to the dorsal raphe nucleus reduces passive coping and perseverative reward seeking in rats

◆ Materials and Reagents（材料与试剂）糖精、清洁水、千分秤

◆ Equipment （仪器设备）Lickometer舔舐行为测试系统

02.Principle（原理）

糖水偏好测试是一项简单的任务，用于评估啮齿动物模型中的动机、抑郁(和无快感)及相关情绪状态，也用于更复杂的模型，如产后抑郁症和停药等。

1981年，Katz等人首次在抑郁大鼠造模过程中发现，应激后的大鼠蔗糖和糖精水的消耗减少达50%，并进一步发现三环类抗抑郁药丙咪嗪可显著增加模型组大鼠糖水的消耗量，随后Willner等使用糖水偏好实验对CUMS（Chronic unpredictable mild stress，慢性轻度不可预见刺激应激模型）大鼠进行评价，发现随着应激时间的延长和应激强度增加，模型大鼠的糖水消耗率明显下降，且该结果可被抗抑郁药物去甲丙咪嗪改善。该实验同时排除了大鼠糖水消耗减少是出于热量调节失调或应激后血糖升髙引起糖水摄入量降低的猜想。此重要发现说明了内源性抑郁症的核心特征是奖励机制缺陷和快感缺乏。现代研究表明，作为中脑“奖励ZX”的单胺核团，多巴胺系统边缘通路与奖赏机制有关叫外侧缰核则是大脑的“反奖励中 枢”，其簇状放电方式增强了对腹侧被盖区与中缝背核的抑 制，进而导致了快感缺失与行为绝望，是抑郁症发生的充分条件。

03.Protocol （方法步骤）

◆ Day1-3：适应实验房间（单笼饲养，双饮水瓶均装洁净自来水，自由饮水摄食）；Handle（5min/天将动物放在手上轻柔把玩）（测试开始于测试结束时均要称量记录水瓶重量）；

◆ Day4：双瓶均为水（测试开始与测试结束时均要称量记录水瓶重量，剔除有饮水偏好的动物）；

◆ Day5：双瓶均为1-2%糖水（测试开始与测试结束时均要称量记录水瓶重量）；

◆ Day6：8am-2pm进行实验，动物可自由摄取两瓶水/糖水（测试开始与测试结束时均要称量记录水瓶重量）。

04.数据分析方法

糖水比例（%）=【糖水摄入量/（糖水摄入量+水摄入量）】*100%同时也可以分析舔舐次数变化。

*注意事项

1. 水瓶滴漏：避免水瓶地漏，造成称量重量出现偏差

2. 品系差异：如，李斯特（Lister）带帽的大鼠在浓度为1％时显示出明显的蔗糖偏爱，而威斯塔（Wistar）大鼠则没有。与C57BL / 6J小鼠相比，129P3 / J小鼠对蔗糖或麦芽糊精加糖溶液的偏爱性较低

3. 性别差异：如，Wistar Kyoto雄性大鼠的蔗糖偏爱率低于雌性。京都Wistar雄性大鼠表现出应激诱导的蔗糖偏爱损失，而雌性则没有。相反，雄性和雌性Sprague Dawley大鼠在慢性轻度应激后均表现出蔗糖偏爱的降低

实验动物该怎么选择？

不同脑缺血模型，弄不清对应构建方法？

常用的血流监测技术，你都掌握了吗？

「全线赋能·“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第五期为大家聚焦

《脑缺血模型构建及检测》

从实验动物的选择、不同模型的分类

各个模型的构建方法到血流监测技术

两位老师将进行综合详细的讲解

全面助力你的科研实验研究

直播时间

6月21日（周二）19：00

报名方式

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主题：脑缺血模型构建

• 脑缺血研究背景

• 脑缺血动物模型构建

• 脑缺血模型构建实验仪器

讲师：孙绍强

瑞沃德行业解决方案专家，在膜片钳/钙成像/干细胞诱导方面有着丰富的实验经验，曾参与多项重大研发及自然科学基金项目，曾在Cell Stem Cell 上发表论文，专注于神经疾病，脑缺血及神经退行性疾病模型制备和机制研究，已为上百家客户提供专业的神经疾病整体解决方案。

主题：脑卒中研究中的血流监测技术

• 激光多普勒

• 激光散斑

• 超声多普勒

• 核磁共振成像

• 双光子显微镜

讲师：殷维君

瑞沃德微循环监测解决方案专家，在生理信号监测和血流血氧成像领域拥有丰富的经验，主导动物活体成像解决方案的设计及优化，专注于临床及临床前微循环监测解决方案的构建。

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

Q1：组织剪切的大小有没有具体要求，肿瘤组织一般2-4mm可以吗？

A1：这要根据组织类型去判断，一般会预处理成10mm左右的组织块，太大可能会导致处理不完全，太小可能导致细胞死亡增加，甚至导致样本变稠等。

Q2：细胞活率80%就可以了吗，看到一些资料写的都要90%以上。

A2：这个需要根据下游实验的需求灵活调整，如果样本存活率不能达到要求的话，除了优化实验条件以外，还可以通过一些死细胞去除的试剂来优化已获得的样本。

Q3：低温解离细胞与常规的37度制备单细胞优势分别是什么？区别是什么？

A3：37℃条件下进行组织解离，由于细胞转录活跃，因此解离过程中基因表达可能会发生改变，可能会干扰应激反应相关基因表达，所以在进行snRNA-seq时可以通过使用冷活性酶释放细胞核，同时一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用低温解离的分离方式，但是低温条件对一些质密难解离的组织的处理效率可能会降低。

另外，温度对不同细胞种类也有一定影响，比如在进行脑组织解离时，热解离可能会影响神经元和星形胶质细胞的获取，但是会大量富集小胶质细胞，所以在进行组织解离时，根据获得目的细胞的需求要灵活调整解离方案。

Q4：裂红处理有什么注意事项吗？

A4：如果直径6-8μm的细胞占比较高，且有核率偏低，这表明红细胞含量可能较多，需要进行红细胞裂解，如果红细胞裂解依然不干净，不建议增大裂解体系，建议适当延长裂红时间，或适当增加裂红次数。

Q5：流式染色时间及温度如何选择？

A5：染色本身取决于抗体抗原之间的结合能力，染色时间和温度，受限于抗体浓度，一般根据选择抗体的说明书推荐的浓度和孵育时间、温度选择。我的实践经验：当不清楚说明书的情况，我会选择室温染色12-15min（取决于抗体浓度微调），或4度冰上30min。注意染色时间尽量不要让细胞破损，否则死细胞碎片会影响流式结果。此外细胞消化完毕后应该尽快染色处理，特别是一些凋亡染色、胞内酶染色为保持细胞物质活性，应尽快染色。

Q6：请问流式细胞实验中单抗进行荧光需要什么样的对照？

A6：关于对照设置，这个比较复杂，一般我们是选择同型对照作为阴性对照组，得到的结果往往是比较好的。所谓的同型对照就是同种属同亚型、相同荧光标记物、使用剂量和浓度相同，且属于非特异性结合的抗体为同型对照组。通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 

还有一类就是最常见的纯阴性对照，检测细胞群不进行任何抗体处理，直接进行流式检测，这就是简单消除细胞和溶剂本身的影响，这种方法的好处是节约抗体，毕竟抗体很贵。

Q7：如何减少补偿的干扰？

A7：补偿干扰往往是多激光的流式仪器才会发生一定干扰情况，此时，可以根据抗体公司提供的染料搭配方案选择比较好，也就是发射光谱的波长峰尽量不重叠的染料，这样补偿干扰会尽量消除。因此，往往需要查看染料的波长范围，此外，对于4色以上的多色标记情况，一般不常见，此时往往染料的波长范围难以避免的重叠，这时候，推荐使用抗体公司推荐的配色方案，尽量避免发射光谱的重叠。此外很多流式仪器配套软件都带一定算法对补偿进行修正，可以适当修正这个影响。

Q8：细胞自发荧光如何解决？

A8：细胞自发荧光往往是细胞内物质带有荧光，植物细胞因为叶绿素原因会自带一定荧光，然后一些药物处理下，药物本身带有发色基团，也可能自荧光，此时，纯阴性对照的设置可以补偿一定的情况。然后就是染料的选择情况，染料荧光波长范围避免与细胞自发荧光的波长的重叠，这样会比较好一些。我之前做药物的细胞凋亡实验时候，考虑到药物的情况，就没有使用常见的凋亡检测的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。尽量设置纯阴性对照、有条件做下同型对照，往往可以在数据处理时候适当减少部分因素的影响。这样流式的结果会更好。

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• 第一课：阿尔茨海默症模型

• 第二课：帕金森病模型

• 第三课：脑缺血模型

• 第四课：抑郁模型

• 第五课：焦虑模型

• 第六课：创伤后应激障碍模型

• 第七课：自闭症谱系障碍模型

• 第八课：成瘾模型

• 代谢类疾病研究手术与造模手册大全

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下期内容预告：

常见疾病动物模型——构建方法系列2

动物实验在大多数神经科学领域研究中均占有重要地位。主要原因在于：细胞分子水平发现的现象，转换为动物整体研究，再转换为临床成果的三个阶段均会有极大的失败率。而且，细胞实验上临床检测之前，也需要先有大量动物实验。所以常规为了更好的促进研究向临床研究转化，采用动物实验检测相关研究的有效性是不可缺少的。而行为学是动物实验中的重要组成板块之一。

然而，动物行为实验常见的难点有以下三大类：

1. 实验周期长。常规动物实验包含繁殖期、适应期和实验期，整体需要60-120天方可完成一组实验，其成果产出的效率远远不如细胞和分子实验；

2. 影响因素复杂。动物作为一个整体，具有较强的自我恢复调控能力，直接导致分子细胞水平的有效干预手段，在行为实验中失去了应有的作用；

3. 实验分组设计复杂。不同干预条件下，实验分组区别较大。若实验设计中分组不够严谨，会直接导致实验组与对照之间缺乏统计学差异。

第 一类可以通过直接购买第三方厂家繁育动物得到一定缓解，若采用自繁育扩增基因鼠，则需要建立完善的实验室与动物房（实验室与动物房建立可参考文章→行为学实验室该如何布局？）。

第二类需要通过足够的预实验对干预手段进行验证。

而第三类，我们实验人员需要通过广泛文献阅读与深入思考总结规避该类难题。我们通过大量文献阅读及与行业专家沟通总结了常规分组方法如下：

01.手术造模行为学分组

手术造模一般分为自身对照与标准对照两种方式。自身对照可分为前后对照，或者对侧对照等。标准对照一般会将动物分成三组：正常组，模型组和假手术组（Sham组）。三组动物保证完全一样的饲养条件。

• 正常组未进行过手术造模。

• 模型组指按实验需求进行造模，如MCAO脑缺血造模，脊髓损伤造模等。

• 假手术组指进行了手术但是没有实质性损伤的动物，如MCAO脑缺血造模的假手术组即分离了颈动脉，但未进行结扎的动物，脊髓损伤的假手术组即剥离了动物椎板暴露出脊髓，但未对脊髓造成损伤的动物。

如MCAO脑缺血和脊髓损伤这种相对较复杂的手术造模，除了血管栓塞和脊髓损伤以外，分离颈动脉血管，剥离椎板这些操作实际上也对动物造成了一定的损伤。因此假手术组与正常组的实验结果也会存在一定程度的差异。设立假手术组能帮助我们验证手术操作是否引发实验数据的差异。

02.动物给药行为学实验分组

抛开给YF式从整体来看，一般会把动物分成四组，分别为空白对照组，给药实验组（可设置给药浓度梯度），阳性给药对照组和安慰剂（溶剂）组。空白对照组为不进行给药的动物；给药实验组是验证目的药物药效用，一般会设置3-5个浓度梯度验证不同浓度药物药效；阳性给药对照组主要作为实验的阳性对照，以此判断目的药物的LX。一般采用药物为目前行业公认的和目标药物作用靶点相同或者ZL症状相同的药物进行给药的组别，如MK-801、Ketamin等ZL抑郁；安慰剂（溶剂组）则是使用生理盐水或者目的药物的溶剂进行给药，作为实验的阴性对照，判断溶剂和给YF式是否对动物有影响。

在实验过程中，因为正常组无需进行给药，一般会在安慰剂（溶剂）组动物出现与实验预期不符的症状时，再使用同批次动物（实验条件不允许时也可用相同来源同种动物代替）补充。当使用非常规溶剂进行药物配制时（除纯水，PBS，生理盐水，葡萄糖以外的溶剂），均需要设置溶剂组，确认溶剂本身对动物没有作用。

03.转基因动物行为学检测实验分组

转基因动物因其干预手段涉及因素更多，使得其研究分组更为复杂。下面我会以小鼠为例列出几种情况来进行说明。

稳定遗传的转基因小鼠

很多转基因小鼠品系稳定，已实现商业化。如5xFAD，Ptenflox等，可以在一些转基因动物厂家购买到，并通过自行繁育进行扩群，仅需进行基因型鉴定即可实验使用。这些动物通常会用来验证药物对已知动物疾病模型的作用。

一般分为四组：空白对照组，实验组、阳性对照组、阴性对照组、转基因背景鼠。转基因背景鼠一般为同笼鉴定出的阴性鼠或者转基因品系的背景鼠作为正常对照，和转基因阳性鼠的正常组或安慰剂组以相同模式给药，用于评估目的药物的治LX果。

自行进行基因编辑动物

若自行在实验室利用CRISPR或者Cre-LoxP等转基因技术对小鼠进行基因敲除或者过表达，以进行某特定基因研究。一般会将动物分成3组：对照组，转基因组，和回复组（根据实验目的，在初期验证转基因性状时无需设立，后续研究基因回复作用时需要设立）。

转基因组指经过鉴定的转基因阳性鼠；回复组指利用技术手段将转基因敲除或过表达的基因回复到正常表达水平的鼠；而对照组则有很多个选择的方向，如转基因鼠的背景鼠，工具鼠的空载鼠（如搭载了空载的cre，cas9，FLP的鼠等），同笼的阴性鼠等。

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如何才能通过实验动物福利伦理审查？

吸入式麻醉有哪些需要注意的要点？

投稿被拒，竟是麻醉不符合动物福利？

动物麻醉气管插管不好操作？

「全线赋能“沃”的实验」之实验方法实战教程

第一季收官直播第八期带你聚焦

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8月9日（周二）19：00

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课程1：科学认识实验动物福利

• 定义及反对者的声音

• 动物福利和伦理

• 伦理审查

讲师：饶秀茸

拓普生物副总经理，毕业于广东医科大学，拥有十五年动物实验和动物房管理从业经验，专注研发与专利撰写，曾主持参与深圳市科创委、广东省重大科技专项项目等课题。

课程2：动物呼吸麻醉原理全解

• 吸入式麻醉

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• 应用案例

讲师：王晓雨

瑞沃德资深解决方案专家，毕业于深圳大学，在动物呼吸麻醉方面深耕多年，目前已服务全 球超500家单位，致力于在全 球推广更符合动物福利的呼吸麻醉方案。

课程3：气管插管实操

• 气管切开插管法

• 经口插管法

• 吸入式麻醉实操

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

1. 如果我只想激活一种类型的神经元应该怎么办？

答：研究的目标脑区内有多种类型的神经元，只激活其中一种类型表明需要实现细胞类型特异性刺激，几类刺激脑方法中只有光遗传刺激能够满足，通过特异性病毒载体，将光敏蛋白转染到某一类型细胞上，从而实现细胞类型特异性刺激。

2. 我埋的刺激电极总是会掉该怎么弄？

答：可以在埋植电极的同时，在颅骨附近先埋植两颗颅钉起固定作用。

3. 使用经颅电刺激能只激活一种类型的细胞吗？

答：经颅电刺激作用于一片刺激范围内的所有细胞，不能只激活一种细胞。

4. 感觉刺激中，为什么要选择40Hz的频率？

答：PPT解析的文献里研究的是AD小鼠，与认知相关。认知损伤的小鼠其Gamma频段的神经振荡也发生改变，40Hz属于典型Gamma频段，因此使用40Hz刺激诱发小鼠大脑Gamm频段的振荡。

5. 光遗传为什么给光就能激活或抑制神经元？

答：光遗传技术利用分子生物学、病毒生物学等手段，将外源光敏感蛋白基因导入活细胞中，在细胞膜结构上表达了光敏感通道蛋白；然后通过特定波长光的照射，控制细胞膜结构上的光敏感通道蛋白的激活与关闭；光敏感蛋白的激活和关闭可控制细胞膜上离子通道的打开与关闭，进而改变细胞膜电压的变化，如膜的去极化与超极化。当膜电压去极化超过一定阈值时就会诱发神经元产生可传导的电信号，即神经元的激活；相反，当膜电压超极化到一定水平时，就会抑制神经元动作电位的产生，即神经元的抑制。

6. 在脑刺激的过程中，能够同时进行脑电采集吗?

答：这需要看是哪种脑刺激方法。经颅电刺激和深部脑刺激不建议同时记录电信号，会存在干扰。光遗传刺激能够同时进行脑刺激和脑电采集，光遗传通过光进行刺激，而不是电刺激，因此不存在干扰。

7. 光遗传的刺激参数如何选择呢？

答：光遗传实验的参数有频率，脉宽，功率等。光遗传刺激的频率根据不同的实验需求而有所不同，具体情况可参考已发表的文献进行选择。刺激时不要超过通道蛋白的响应频率，不然容易出现脱敏效应。脉宽与占空比相关，在频率固定的情况下，可通过提高脉冲宽度从而提高占空比。光功率强度的选择与对应的通道蛋白有关，激活不同的光敏蛋白有不同的光功率要求。

8. 脑机接口读取到写入的闭环时间限度要少于多少呢？

答：依据任务而异，不同的任务类型对时间的要求不同。例如在常见的字符输入任务中，对时间要求不严格，延迟也没关系。

9. 无创脑机接口的外部噪音影响会不会很大？

答：无创式脑机接口容易收到外界噪音的影响，针对实验过程涉及到的外部环境、采集硬件及软件算法都需要特别注意，需要做一定程度的降噪处理。使用的电极也会对信号的噪音有一定影响，一般湿电极信号质量优于干式电极装置记录的信号质量。实验被试人员也需要注意采集期间尽量不要产生任务需求之外的移动。

10. 全植入式的电极深度在动物模型上有没有限制？

答：一般来说没有限制，但是在实际操作过程中需要考虑具体的实验对象。植入的区域多是皮层，处于脑部相对靠外的位置，不会特别深，植入过程中注意避开血管的位置。植入区域的深度多和使用的电极类型相关，例如犹他阵列电极只适合于进行大脑皮层记录。意识活动产生的脑区（NCC）很多位于丘脑等深部脑区，目前技术无法达到。

11. 全植入式电极植入获取有效数据的时间大概多久，信号衰减的主要原因有哪些呢？

答：一般良好的手术植入操作能维持半年以上的信号采集，也有一年以上还能继续采集信号的。信号衰减的原因多是植入的电极随着时间的延长，逐渐被类似“疤痕组织”的细胞所包裹而失效，或者是电极老化脱落。

12. 无创式、半植入式以及全植入式这3种不同方法对于完成闭环任务是否有时间上的差异呢？

答：没有显著的差异。延迟时间的差异主要取决于信号的传输、处理、外部设备的响应等各个方面。一般来说，植入式的会比无创的信号时间精度更好，可以完成更多复杂精确的任务。

13. 非侵入式远程收集脑电用什么技术呢？

答：一般是将普通有线的方式更换为蓝牙或者WiFi都可以。

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这期主要聚焦于学习记忆三类常规使用的开放性迷宫：

• RM：Radio-Maze（放射迷宫）

• NORT：New Object Recognize Test（新物体识别）

• TC：Three Chamber（三箱社交）

放射迷宫

01.实验原理

放射迷宫是由Olton等人于20世纪70年代中期创建，根据实验目的和选择放射臂数目不同，可分为8、16、24、32、40、48臂迷宫。其中，八臂放射状迷宫应用较广泛。它主要是利用限食手段，以此提高动物对食物的渴望，驱使动物对有食物的迷宫各臂进行探究，记住食物在迷宫中的空间位置。

02.参考文献

• Ortega-Alvaro Antonio, Gibert-Rahola Juan, Micó Juan A, Influence of chronic treatment with olanzapine, clozapine, and scopolamine on performance of a learned 8-arm radial maze task in rats.[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2006, 30: 104-11.

• Suzuki S, Augerinos G, Black A H . Stimulus control of spatial behavior on the eight-arm maze in rats[J]. Learning & Motivation, 1980, 11(1):1-18.

03.实验材料

八臂迷宫，摄像系统，Smart V3.0行为学视频记录分析软件。

04.实验方法

（1） 实验开始前：对动物进行节食，使动物体重保持在正常体重的85%-90%，第 一次试验前动物需禁食一天；

（2）实验1-3天：在迷宫各臂及ZY区域放置食丸，每个区域放3-5个，每次同时放入4只动物在迷宫中间，让动物自由活动10分钟；

（3） 实验第4天：开始进行单只动物实验。在迷宫各臂靠近食槽处放置一个食丸，将动物放到迷宫ZX区域进行自由探索，食丸吃完或自由活动10分钟后结束任务，每天2次；

（4）实验第5天：将食丸放到食槽中，将动物放在迷宫ZX区域进行自由探索，食丸吃完或自由活动10分钟后结束任务，每天2次；

（5）实验第6天开始：随机选择四个臂，在食槽中放入食丸。关闭各个臂门，让动物在ZY区域自由活动30s，打开臂门让动物自由活动。食丸吃完或自由活动10分钟后结束任务，每天2次，间隔1小时以上；

（6）当对照组动物连续5次实验，工作记忆错误为0，参考记忆错误平均不大于1时，结束实验。

05.数据分析

（1）记录四种数据随学习时间变化的曲线，错误次数降低越快，完成任务时间越短，说明动物学习记忆能力越强

• 工作记忆错误：同一次训练中动物进入已吃过食物的臂的次数

• 参考记忆错误：动物进入不曾放过食物臂的次数

• 总入臂次数

• 完成任务总时间

（2）采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法

（3）P<0.05认为具有统计学显著性差异

06.数据示例

07.注意事项

• 每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味

• 对于记忆学习快的动物，相对摄食较多，节食应该多一些

物体认知

01.实验原理

1988年，Ennaceur等研究人员基于动物天生对新奇物体的探索特性，建立了新物体识别。利用啃齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本能来检测动物学习记忆能力。由于该方法不需要学习训练，无需禁食禁水，不用施加惩罚或奖赏刺激，对动物的应激影响较小，与人类再认记忆检测相似等优点而被广泛运用。

02.参考文献

• Fernandez, D.C., Fogerson, P.M., Lazzerini Ospri, L., Thomsen, M.B., Layne, R.M., Severin, D., Zhan, J., Singer, J.H., Kirkwood, A., Zhao, H., et al. (2018). Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell 175, 71-84 e18.

03.实验材料

物体识别箱，摄像系统，Smart V3.0行为学视频记录分析软件。

04.实验方法

新物体识别

（1）适应期：1-3天，将动物放入空的物体识别箱中熟悉环境，每天一次，每次10分钟

（2）熟悉期：适应期结束后，在箱体内放置2个相同的物体，放入动物进行探索5-10分钟

（3）实验期：熟悉期结束后间隔一段时间（短期记忆推荐30分钟，长期记忆推荐一天）， 将一个物体替换为一个形状造型不同的物体，放入动物进行探索与熟悉期一致的时间

位置物体识别

（1）适应期：1-3天，将动物放入空的物体识别箱中熟悉环境，每天一次，每次10分钟

（2） 熟悉期：适应期结束后，在箱体内放置2个相同的物体，放入动物进行探索5-10分钟

（3）实验期：熟悉期结束后间隔一段时间（短期记忆推荐30分钟，长期记忆推荐一天）， 将一个物体变更一个位置摆放，放入动物进行探索与熟悉期一致的时间

05.数据分析

（1）动物分别对两个物体的嗅探观察时间，观察两个物体时间的比例

• 熟悉期：若动物对一个物体观察时间占比大于60%，则需要剔除这只动物的数据

• 实验期：动物对新物体观察时间占比大于60%说明动物识别出了新物体; 记忆好坏程度主要与对照组观察新物体的时间比例相比较得出结论

（2） 采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法

（3） P<0.05认为具有统计学显著性差异

06.数据示例

07.注意事项

• 每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味

• 物体建议使用形状不同，颜色不同的物体，动物区分程度高

三腔社交

01.实验原理

社交实验是判断动物社会活动的一种方法，在自闭症的研究中有着广泛的应用。由于啮齿类动物天生喜欢接近和探索新物体，三腔社交实验除了可以应用于自闭症的研究，还广泛用于学习记忆的研究中。本次介绍用三腔社交研究学习记忆的实验方法。

02.参考文献

• Donegan, M.L., Stefanini, F., Meira, T., Gordon, J.A., Fusi, S., and Siegelbaum, S.A. (2020). Coding of social novelty in the hippocampal CA2 region and its disruption and rescue in a 22q11.2 microdeletion mouse model. Nat Neurosci 23, 1365-1375.

03.实验材料

三腔社交箱，摄像系统，Smart V3.0行为学视频记录分析软件。

04.实验材料实验方法

一共包含5个环节，每个环节检测10min

（1）箱体熟悉期：将受测动物从中间箱体放入整个箱体中（不包含小鼠笼具），让其自由活动10min

（2）笼具+箱体熟悉期：将动物笼具放入箱体，随后将动物放入箱体内熟悉整体环境，让其自由活动10min

（3）社交熟悉期：在左右笼具中均加入同笼动物1只，随后将实验动物放入其中，另其自由活动嗅探10min

（4）新动物社交实验检测：将其中一个笼具动物换为与实验鼠非同笼、陌生动物，随后将实验鼠放入箱体进行社交实验监测，自由活动10min。

（5）熟悉社交实验监测：将步骤4中被替换掉小鼠放回原笼具，再次将实验鼠放入箱体内，进行熟悉社交检测。

05.数据分析

（1）动物的交互行为有多种评判标准，SMART3.0根据自己独特的算法，可以更为精确的判断交互行为。

（2）动物分别与两只鼠（笼子）产生交互行为的时间，与两只鼠（笼子）产生交互行为时间的比例

• 测试期1：主要进行动物社交行为测试。若动物有社交的倾向，则与左侧有动物的笼子的交互时间会比右侧空笼子的交互时间长，交互时间占比大于60%。

• 测试期2：主要进行动物记忆能力测试。若动物短期记忆能力良好，则与右侧新动物的交互时间会比左侧动物的交互时间长，交互时间占比大于60%。

（3）采用单因素方差分析（one way-ANOVA），当多组间有差异时，两两比较采用Fisher's LSD post hoc多重比较方法

（4） P<0.05认为具有统计学显著性差异

06.数据示例

07.注意事项

• 每只动物实验结束后应进行环境清理，尽可能去除上一只动物的气味

• 选择社交笼中的动物时，推荐选择同品系，同周龄的异性动物，会让动物更加倾向于进行交互行为

• 社交实验不同动物间会有很大的差异，建议实验时加大每组的动物数量，建议每组使用15-18只动物

• 视频软件追踪过程中，建议开启三点识别，追踪头部轨迹，以头部嗅探为社会交互。

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