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血球计数板

你知道吗？血球计数板自18世纪首次被应用于分析人的血液样本以来，逐渐发展为实验室细胞计数的标准工具。因为其操作简单，对实验环境要求不高，只要有一台显微镜即可进行细胞计数操作。但如果想使用它得出较为精 准的结果则对操作者的要求很高，因为在操作时可能会带来各种误差：

1、计数操作引入误差

血球计数板使用步骤较为复杂，计数结果的准确度不仅和上样后铺满计数池的均匀程度相关，同时浓度较高时的镜下计数难度较大，不同操作者之间的计数差异甚至高达52%，即使同一个人的操作差异仍有可能达20%[1]。所以需要在实际计数过程中，同一操作者在相同的条件下进行多次计数以减小误差[2]。

2、计算过程引入误差

通过血球计数板获取的数据结果，需要在镜下一边计数一边记录，再对结果通过一系列的计算，从而转化成实际的细胞浓度数据，然后计入细胞原液的稀释倍数（如台盼蓝的稀释等），即可得到目的细胞样品的浓度。计算过程中的误差也会影响到最终的实验结果[3]。

3、样品制备引入误差

首先，均匀细胞悬液样本的准备对计数结果的准确性至关重要。对于某些极易聚团或未能均匀打散的细胞悬液，人工计数时，往往不易识别导致误差被放大。其次，依据大多数实验室的习惯，通常会采取对四个顶角的大格内的细胞进行统计计数，每个大格的细胞量一般在30-50个之间时，计数结果会更加准确。这就意味着，细胞悬液浓度过高或过低都不利于获得准确的结果。多数情况下，我们需要对悬液进行有效的稀释。

另外，不仅操作因素会导致误差出现，本身血球计数板的设计对标准化的操作流程也有一定考究。

据一项研究表明，在计数过程中，盖玻片的位置偏移可造成7.6%的计数差异[4]，不同品牌的盖玻片质量厚度对样品的均匀扩散也会有一定影响。同时血球计数板计数的视野面积也影响着计数的准确度，常用计数板进行普通细胞系计数时的计数面积为1mm2，取样面积越小，CV值越高、误差越大[5]。并且，若血球计数板清洁过度、清洗不到位或操作不当导致计数室存在划痕会对操作和结果都造成很大影响，被清洗掉的细胞样本若不妥善处理也会将操作者暴露在生物安全危险下。

计数板的计数面积

很多研究者已经逐渐使用机器的自动计数来代替手动计数，相对来讲各方面因素更好控制，得出的结果可靠性更高，目前细胞计数的金标准仍为最为可靠的流式细胞术检测，但是其高昂的仪器价格和维护成本导致其普及程度和覆盖情况还不是很广，所以自动细胞计数仪是目前性价比更高的解决方案。为什么自动细胞计数仪是自动计数最佳方案？

首先，机器计数可减少人工计数过程中造成的误差，通过软件算法直接获得数据结果，其中图像式的计数仪还能生成清晰的样本图像进行保存，方便后续数据处理。

第二，机器自动计数后会根据相应的公式运算规则直接得出结果，并且还会内置辅助计算软件，将人为计算造成的误差降到最小。

第三，相对来说机器计数对样品制备的要求没那么高，由于技术和算法的区别，比手动计数能识别的浓度准确区间更大，样本的预稀释操作在一定程度上被简化，同时对难离散的细胞悬液中的聚团细胞进行分别识别并独立计数，提高对分布不均匀样品计数的准确度。

图像式计数仪采集面积3.5mm2 VS 手动计数1mm2

并且，机器计数一般使用相应的一次性耗材，不仅不需要盖玻片等额外的耗材，减少上样操作造成的样品扩散不均，继而影响计数结果，同时一次性耗材无需清洗，保证重复性也避免了生物安全危害。另外图像式的计数仪的采样面积一般是人工计数的几倍，采样面积更大计入细胞更多、更准确。还有很多计数仪有荧光功能，不仅能完成正常的计数操作，还可对不同的荧光标记物进行识别统计。

瑞沃德自动细胞计数仪可对悬液中的细胞快速进行精 准定量分析，并同时显示明场及荧光图像，清晰呈现计数结果及细胞形态。计数面积更大，应用方位更广。适用于免疫学及疫苗开发、细胞治疗、肿瘤研究、干细胞及代谢研究等研究领域的细胞分析。

【参考文献】

[1] Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.

[2] Davis JD. THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE. Urbana: University of Illinois at Urbana-Champaign; 1995.

[3] Christensen P, Stryhn H, Hansen C. Discrepancies in the Determination of Sperm Concentration using Bürker-Türk, Thoma and Makler Counting Chambers. Theriogenology 2005; 63: 992-1003.

[4] Sanders C, Skerry DW. The Distribution of Blood Cells on Haemacytometer Counting Chambers with Special Reference to the Amended British Standards Specification 748 (1958). Journal of Clinical Pathology 1961; 14: 298-304.

[5]Ramsey JM. The Effects of Size of Sampling Area and Dilution on Leucocyte Counts in a Hemocytometer. The Ohio Journal of Science 1969; 69(2): 101-4.

什么是细胞计数？

       计数是细胞培养过程中不可或缺的重要步骤之一。 运用专业有效的计数方法，可以准确的测定细胞数量，检测细胞的活力状况（活细胞的比例），这对细胞培养过程中的环境条件的控制、细胞生长状态的监控，至关重要。

准备工作

1、血细胞计数板预处理

       用酒精清洗并擦拭盖玻片，并让酒精自然挥发干。

2、细胞悬液的准备

       悬浮细胞可直接通过取样，离心，重悬后，直接获取细胞悬浮液。贴壁细胞可使用胰蛋白酶进行消化后离心、重悬。

       轻轻用移液枪吹打细胞悬液3-5次至细胞均匀分布在液体中。

       立刻吸取10-20 µL的细胞悬液样品至新的微量离心管中，并按照1:1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染液，混匀后，静置1-2分钟。

细胞计数板的构造

加样计数

       轻轻吹打染色后的细胞样品，吸取10-12 µL加至血细胞计数板凹槽处，利用毛细现象使样品均匀铺开。

       在显微镜下对准计数板样品区域，用10倍物镜聚焦至计数板的网格线上。

       视野中，活细胞会拒染台盼蓝，呈现透亮的光泽，边缘轮廓清晰，死细胞则被台盼蓝染色，呈现出不透明的蓝色。对计数板四角的四个大格中的细胞进行计数（需要测定细胞活力时，活细胞、死细胞需分开单独计数）。对于压住四周边缘线的细胞，仅将其中2条线作为压线细胞可计入计数的范围（如仅计算左边和顶部两条线的压线细胞）。

       移动计数板，至视野内出现移至下一组16个角格的大格进行计数，直到所有4组16个角格全部计数完毕。

样品中细胞浓度的计算

计算过程

       假设四个角方格计数分别为A、B、C、D。

       四组16个角方格计数出的细胞总数为 (A+B+C+D)。

       取每组16个角方格的平均细胞数即 (A+B+C+D)/4。

       则计数样品中的细胞浓度为 (A+B+C+D)/4 x10⁴个/mL。

       （血细胞计数板每个大方块可以容纳的体积为：1mm²×0.1mm=0.1mm³=10^-4cm³=10^-4ml，即每个大方块的体积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需要乘以10⁴）

       则加入台盼蓝之前的细胞原液的浓度为上述浓度的2倍 (A+B+C+D)/2 x 10⁴个/mL。

       假设上述计数过程中四个角方格中的活细胞数目为E，死细胞数目为F。

       细胞活力（活细胞比例）=E/(E+F) x

应用举例

       如果16个方格的细胞计数分别为51、42、47、55，则计数样品中的细胞浓度为

(51+42+47+55)÷4x10⁴x2=9.75x10⁵个/mL 

温馨小Tips

       1. 血细胞计数板为玻璃材质，在使用前后需小心处理、轻拿轻放，避免摔碎。

       2. 台盼蓝染料内往往会存在一些不溶的杂质，干扰计数结果。因而，在染色前对台盼蓝染料进行离心，吸取上清使用有利于减少杂质引起的计数误差。

       3. 台盼蓝染料有一定的细胞毒性和致癌性，确保染色后的细胞在10分钟以内完成计数，并且避免皮肤直接接触。

       4. 加样至计数板凹槽时，确保细胞悬液均一地在盖玻片和计数板之间铺平，如有细胞在计数区域产生，会影响计数结果的准确性。

       5. 计数图像的清晰度对计数结果的准确度有较大的影响。计数前请务必确保调整相机的焦距至激光蚀刻线清晰可见，此时活细胞中部有明显的光泽、轮廓清晰。

       6. 四个大格内的细胞总数控制在100-200个之间时，计数的准确度更好，细胞浓度过低或者过高都会影响计数结果。聚团细胞按一个细胞计算，但若视野中出现的聚团细胞较多，需考虑样品制备时消化过程是否处理不当。

       7. 为了减少单次计数的误差，可对一个样品进行多次计数取平均值。