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什么是细胞计数？

       计数是细胞培养过程中不可或缺的重要步骤之一。 运用专业有效的计数方法，可以准确的测定细胞数量，检测细胞的活力状况（活细胞的比例），这对细胞培养过程中的环境条件的控制、细胞生长状态的监控，至关重要。

准备工作

1、血细胞计数板预处理

       用酒精清洗并擦拭盖玻片，并让酒精自然挥发干。

2、细胞悬液的准备

       悬浮细胞可直接通过取样，离心，重悬后，直接获取细胞悬浮液。贴壁细胞可使用胰蛋白酶进行消化后离心、重悬。

       轻轻用移液枪吹打细胞悬液3-5次至细胞均匀分布在液体中。

       立刻吸取10-20 µL的细胞悬液样品至新的微量离心管中，并按照1:1的比例加入等量的0.4%的台盼蓝染液，混匀后，静置1-2分钟。

细胞计数板的构造

加样计数

       轻轻吹打染色后的细胞样品，吸取10-12 µL加至血细胞计数板凹槽处，利用毛细现象使样品均匀铺开。

       在显微镜下对准计数板样品区域，用10倍物镜聚焦至计数板的网格线上。

       视野中，活细胞会拒染台盼蓝，呈现透亮的光泽，边缘轮廓清晰，死细胞则被台盼蓝染色，呈现出不透明的蓝色。对计数板四角的四个大格中的细胞进行计数（需要测定细胞活力时，活细胞、死细胞需分开单独计数）。对于压住四周边缘线的细胞，仅将其中2条线作为压线细胞可计入计数的范围（如仅计算左边和顶部两条线的压线细胞）。

       移动计数板，至视野内出现移至下一组16个角格的大格进行计数，直到所有4组16个角格全部计数完毕。

样品中细胞浓度的计算

计算过程

       假设四个角方格计数分别为A、B、C、D。

       四组16个角方格计数出的细胞总数为 (A+B+C+D)。

       取每组16个角方格的平均细胞数即 (A+B+C+D)/4。

       则计数样品中的细胞浓度为 (A+B+C+D)/4 x10⁴个/mL。

       （血细胞计数板每个大方块可以容纳的体积为：1mm²×0.1mm=0.1mm³=10^-4cm³=10^-4ml，即每个大方块的体积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需要乘以10⁴）

       则加入台盼蓝之前的细胞原液的浓度为上述浓度的2倍 (A+B+C+D)/2 x 10⁴个/mL。

       假设上述计数过程中四个角方格中的活细胞数目为E，死细胞数目为F。

       细胞活力（活细胞比例）=E/(E+F) x

应用举例

       如果16个方格的细胞计数分别为51、42、47、55，则计数样品中的细胞浓度为

(51+42+47+55)÷4x10⁴x2=9.75x10⁵个/mL 

温馨小Tips

       1. 血细胞计数板为玻璃材质，在使用前后需小心处理、轻拿轻放，避免摔碎。

       2. 台盼蓝染料内往往会存在一些不溶的杂质，干扰计数结果。因而，在染色前对台盼蓝染料进行离心，吸取上清使用有利于减少杂质引起的计数误差。

       3. 台盼蓝染料有一定的细胞毒性和致癌性，确保染色后的细胞在10分钟以内完成计数，并且避免皮肤直接接触。

       4. 加样至计数板凹槽时，确保细胞悬液均一地在盖玻片和计数板之间铺平，如有细胞在计数区域产生，会影响计数结果的准确性。

       5. 计数图像的清晰度对计数结果的准确度有较大的影响。计数前请务必确保调整相机的焦距至激光蚀刻线清晰可见，此时活细胞中部有明显的光泽、轮廓清晰。

       6. 四个大格内的细胞总数控制在100-200个之间时，计数的准确度更好，细胞浓度过低或者过高都会影响计数结果。聚团细胞按一个细胞计算，但若视野中出现的聚团细胞较多，需考虑样品制备时消化过程是否处理不当。

       7. 为了减少单次计数的误差，可对一个样品进行多次计数取平均值。

虽然我们的工业起步比较晚，但经过几十年的潜心发展，诸如航空航天、高铁等工业领域目前已经在取得了瞩目的成就。工业成果的良好发展，这有赖于拥有良好品质的工业产品，而良好的工业产品则有赖于重要的质量控制及检测设备——工业内窥镜。在严格的工业检测中，我们所用的大多数内窥镜都是进口的，而奥林巴斯进口内窥镜因为拥有比其他内窥镜更大的优势，成为了我们的优先选择。那么，我们用的奥林巴斯进口内窥镜有哪些?

奥林巴斯是一家百年企业，在这百年里，由无数技术研发人员经过无数个日日夜夜，研发出了技术先进，适应于各行各业各种设备的工业内窥镜，不仅有目前较为常用的视频内窥镜，还有各类定制的工业纤维内窥镜、工业刚性管道内窥镜、旋转棱镜硬性管道镜、旋转棱镜变焦硬性管道镜、航空发动机管道内窥镜、MK模块化微型观察镜等。

视频内窥镜

奥林巴斯的视频内窥镜有很多型号，包括便携式内窥镜、手持式内窥镜等，它们均使用高分辨率液晶显示屏，操作简便，检测的结果以高清视频、3D建模和视频/图像记录形式输出，出色画质和亮度让结果更加直观，是业内有名的内窥检测工具。

纤维内窥镜

纤维内窥镜是一种灵活的仪器，它利用光纤束将图像传送到目镜，供检测人员观察。这种内窥镜的直径很小，可以进入到空间狭小的区域中完成内窥检测。

工业刚性管道内窥镜

刚性管道内窥镜的光纤束将来自外部光源的光发送到被检组件中，以照亮检测区域,其光学透镜系统将检测区域的图像传输到人眼中。

旋转棱镜硬性管道镜及旋转棱镜变焦硬性管道镜

这些硬性管道镜的视角可调，观察方向可以从前斜视连续调整到后视角度。与视场结合起来，可以获得120°到140°的总观察弧。旋转棱镜变焦硬性管道镜有点不同，区别在于它添加了2倍光学变焦功能，让图像更加清晰。

航空发动机管道内窥镜

这是和飞机发动机制造商达成的合作，定制出的专业的内窥镜，对航空发动机的检测更加直观，更加符合制造商的标准和要求。

MK模块化微型观察镜

MK微型观察镜，都是超薄的管道内窥镜，直径只有1.2毫米、1.7毫米和2.7毫米，超细的管道大大降低了损坏被检测对象的风险和维修的需要，可完成难度很高的检测，是对汽车进行日常检测的理想设备。

如此多种类的工业内窥镜，有仅1.2毫米的超细管，还有拥有3D测量建模功能的视频内窥镜，涵盖了各种观察方式，适用于各个行业不同要求的检测。工业在发展，设备仪器也在不断升级，奥林巴斯进口内窥镜有哪些我们已心中有数，而这些也是我们所需要的，能够在各行各业发挥重要作用的设备。奥林巴斯作为一家高技术含量的工业内窥镜企业，专注内窥镜的研发制造，未来，将会有更多企业，更多行业用上奥林巴斯工业内窥镜，为工业发展做出了重大的贡献。

血球计数板

你知道吗？血球计数板自18世纪首次被应用于分析人的血液样本以来，逐渐发展为实验室细胞计数的标准工具。因为其操作简单，对实验环境要求不高，只要有一台显微镜即可进行细胞计数操作。但如果想使用它得出较为精 准的结果则对操作者的要求很高，因为在操作时可能会带来各种误差：

1、计数操作引入误差

血球计数板使用步骤较为复杂，计数结果的准确度不仅和上样后铺满计数池的均匀程度相关，同时浓度较高时的镜下计数难度较大，不同操作者之间的计数差异甚至高达52%，即使同一个人的操作差异仍有可能达20%[1]。所以需要在实际计数过程中，同一操作者在相同的条件下进行多次计数以减小误差[2]。

2、计算过程引入误差

通过血球计数板获取的数据结果，需要在镜下一边计数一边记录，再对结果通过一系列的计算，从而转化成实际的细胞浓度数据，然后计入细胞原液的稀释倍数（如台盼蓝的稀释等），即可得到目的细胞样品的浓度。计算过程中的误差也会影响到最终的实验结果[3]。

3、样品制备引入误差

首先，均匀细胞悬液样本的准备对计数结果的准确性至关重要。对于某些极易聚团或未能均匀打散的细胞悬液，人工计数时，往往不易识别导致误差被放大。其次，依据大多数实验室的习惯，通常会采取对四个顶角的大格内的细胞进行统计计数，每个大格的细胞量一般在30-50个之间时，计数结果会更加准确。这就意味着，细胞悬液浓度过高或过低都不利于获得准确的结果。多数情况下，我们需要对悬液进行有效的稀释。

另外，不仅操作因素会导致误差出现，本身血球计数板的设计对标准化的操作流程也有一定考究。

据一项研究表明，在计数过程中，盖玻片的位置偏移可造成7.6%的计数差异[4]，不同品牌的盖玻片质量厚度对样品的均匀扩散也会有一定影响。同时血球计数板计数的视野面积也影响着计数的准确度，常用计数板进行普通细胞系计数时的计数面积为1mm2，取样面积越小，CV值越高、误差越大[5]。并且，若血球计数板清洁过度、清洗不到位或操作不当导致计数室存在划痕会对操作和结果都造成很大影响，被清洗掉的细胞样本若不妥善处理也会将操作者暴露在生物安全危险下。

计数板的计数面积

很多研究者已经逐渐使用机器的自动计数来代替手动计数，相对来讲各方面因素更好控制，得出的结果可靠性更高，目前细胞计数的金标准仍为最为可靠的流式细胞术检测，但是其高昂的仪器价格和维护成本导致其普及程度和覆盖情况还不是很广，所以自动细胞计数仪是目前性价比更高的解决方案。为什么自动细胞计数仪是自动计数最佳方案？

首先，机器计数可减少人工计数过程中造成的误差，通过软件算法直接获得数据结果，其中图像式的计数仪还能生成清晰的样本图像进行保存，方便后续数据处理。

第二，机器自动计数后会根据相应的公式运算规则直接得出结果，并且还会内置辅助计算软件，将人为计算造成的误差降到最小。

第三，相对来说机器计数对样品制备的要求没那么高，由于技术和算法的区别，比手动计数能识别的浓度准确区间更大，样本的预稀释操作在一定程度上被简化，同时对难离散的细胞悬液中的聚团细胞进行分别识别并独立计数，提高对分布不均匀样品计数的准确度。

图像式计数仪采集面积3.5mm2 VS 手动计数1mm2

并且，机器计数一般使用相应的一次性耗材，不仅不需要盖玻片等额外的耗材，减少上样操作造成的样品扩散不均，继而影响计数结果，同时一次性耗材无需清洗，保证重复性也避免了生物安全危害。另外图像式的计数仪的采样面积一般是人工计数的几倍，采样面积更大计入细胞更多、更准确。还有很多计数仪有荧光功能，不仅能完成正常的计数操作，还可对不同的荧光标记物进行识别统计。

瑞沃德自动细胞计数仪可对悬液中的细胞快速进行精 准定量分析，并同时显示明场及荧光图像，清晰呈现计数结果及细胞形态。计数面积更大，应用方位更广。适用于免疫学及疫苗开发、细胞治疗、肿瘤研究、干细胞及代谢研究等研究领域的细胞分析。

【参考文献】

[1] Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.

[2] Davis JD. THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE. Urbana: University of Illinois at Urbana-Champaign; 1995.

[3] Christensen P, Stryhn H, Hansen C. Discrepancies in the Determination of Sperm Concentration using Bürker-Türk, Thoma and Makler Counting Chambers. Theriogenology 2005; 63: 992-1003.

[4] Sanders C, Skerry DW. The Distribution of Blood Cells on Haemacytometer Counting Chambers with Special Reference to the Amended British Standards Specification 748 (1958). Journal of Clinical Pathology 1961; 14: 298-304.

[5]Ramsey JM. The Effects of Size of Sampling Area and Dilution on Leucocyte Counts in a Hemocytometer. The Ohio Journal of Science 1969; 69(2): 101-4.

前言

当我们进行细胞实验的时候，很多时候都会对培养或者消化细胞的数量进行计算，最常规的就是细胞计数了。

原始的细胞计数方法是通过对细胞进行染色，在显微镜下人工观察细胞状态判断细胞死活，进行计数。

显微观察是细胞计数的基本原理，但是人工细胞计数是一件非常耗时耗力的工作，特别是要面对大量样本的计数需求时，因此就衍生出了细胞计数仪。

我们常见的细胞计数仪是这样的：

图源：网络，侵删

这些自动细胞计数仪的原理又是怎样的呢？

它们的底层原理是这样的：

图源：网络，侵删

其实自动细胞计数仪就是一个简化版的显微镜，然后搭载了对图片进行识别的软件功能，从而实现对细胞的计数。

既然自动细胞计数仪可以做到，那么专业显微镜一定可以做得更好。

Echo Rebel和传统的细胞计数仪不同，其具有极高的普适性，无需细胞计数仪的专用耗材，无论载玻片还是培养皿都可以进行计数。

Echo Rebel的细胞计数仪是这样的：

还可以是这样的：

与传统的细胞计数仪相比，Echo Rebel细胞计数采用嵌入式设计，与显微镜融合，细胞计数时间短，普适性高，无需专用耗材，使用和维护成本低。

你以为这就结束了，不，我们还可以这样：

明美MCA30细胞计数仪，让细胞计数更简单

细胞培养和细胞计数是疫苗、细胞治疗、药理、免疫等应用的基础，虽然用显微镜也能实现手动细胞计数，但流程操作比较消耗时间和精力，因此很多细胞房都会选择显微镜和细胞计数仪搭配使用，为了满足这些客户的需求，明美近期新推出了MCA30细胞计数仪。

细胞计数仪MCA30简介

细胞计数仪MCA30是一款智能化的细胞浓度检测仪器，尺寸小巧适合紧凑的细胞房空间，采用高速成像系统搭配智能识别算法，能自动测量明场或者台盼蓝染色样品，每个耗材能检测6个样品，单样品单视野测量时间只需2秒，界面直观，易于操作。

尺寸小巧

细胞计数仪MCA30长宽高仅19.3x8.7x15.8(单位cm)，比显微镜小得多，重量也才1.3kg，可以非常方便地移动和摆放。

软件界面简单易用

细胞计数仪MCA30供电和数据传输都使用Mini USB接口实现，连接的电脑需要使用Win10 64位系统，配置要求不高，可以是台式机、笔记本或者平板电脑，只需安装驱动软件即可连接使用。

测试快速，数据准确

细胞计数仪MCA30使用专用的6孔位计数板耗材，以指示灯提示当前的样品孔位。软件可以根据不同形态细胞微调参数，让智能算法达到CV≤5%的高精度计数，可测的数据包括细胞数量、活率、直径等。

细胞计数仪明场计数操作流程

登陆软件

一切从连接电脑开始，用USB连好电脑后，打开细胞计数仪MCA30驱动软件，输入账号密码进行登录，设备就会对应进行初始化。

准备专用计数板

专用计数板封装在铝箔袋中，前后贴有防刮膜，请撕开取出并把防刮膜撕下，有字面朝上平放在桌面。专用计数板分200微米和100微米两种，200微米样品体积25微升，100微米样品体积14微升，我们下面以200微米版本(25微升)为准介绍。

用涡旋振荡器处理细胞样品,by Todd Jordan

细胞计数仪MCA30能测量1x10^4 - 3x10^7/ml浓度的细胞样品，如果浓度太高需要先稀释，如果浓度太低则需要先富集，开始计数前，请使用涡旋振荡器处理以让细胞分布更均匀。

移液枪加样

调整移液枪到25微升，吸取细胞样品，然后从计数板样品槽两侧孔位其中一个加样。

插入计数板

从专用计数板入口插入计数板，槽位指示灯可以提示现在是在哪一个槽，按提示选择您要测量的槽位。

手动调焦

下一步手动调焦，旋转仪器顶部旋钮并观察软件画面，调节到细胞中央透亮，边缘锐利，就是正确聚焦状态。

配置界面

初次使用，或者换了不一样类型的细胞样品时，需要进入配置界面微调参数。勾选编辑进入设置状态，然后点击刷新效果看看识别情况，如果出现多圈就是识别阈值太低导致识别多了，需要提升细胞阈值参数；反之少圈就是识别阈值太高导致识别少了，需要降低细胞阈值参数。每次调节后用刷新效果看识别情况，调节到位后，务必点击保存，否则不会生效。

分析报告

一切就绪后，回到主界面点击右上角的开始分析，几秒就会出结果，点击综合文档可以看到更多详细信息。

智能识别算法可以支持多种细胞形态，能识别过滤细胞碎片和背景噪声，识别率高、准确率高。

历史数据

测试的结果会自动保存，点击左侧的历史数据标签即可查看以往测试的拍摄图片和结果，用户还可以在这个界面把结果导出成PDF、Excel、JPG等格式。

细胞计数仪台盼蓝计数操作流程

台盼蓝加样

台盼蓝染色样品可以区分活细胞和死细胞进行计数，整体操作基本和明场一致，只有几点差异需要注意。

首先制作样品需要用0.4%的台盼蓝溶液和细胞样品1:1比例混合，并用涡旋振荡器调均匀，然后用移液枪加样到计数板，移液枪的枪头要换新的，避免污染。

注意台盼蓝属于2B级致癌物，请戴手套并在通风环境操作，如果不慎接触到皮肤，尽快用流水冲洗干净。

台盼蓝配置界面

和明场类似，台盼蓝计数在初次使用或者切换细胞类型时，需要先进入设置界面调整参数，而且可能调整幅度要比较大才能达到理想效果，活细胞标记为绿色圈，死细胞会标记为红色圈，您可以调整活细胞和死细胞的阈值来提升识别精度。

注意动作不要太慢，因为台盼蓝有毒性，染色5分钟后细胞可能就会因毒性出现批量损伤，会导致计数结果有误差。

智能分析主界面

在点击开始分析前，注意看清楚要选择台盼蓝模式。

分析报告

点击开始分析，几秒就会出结果，点击综合文档可以看到更多详细信息。

细胞计数仪MCA30

细胞计数仪MCA30相比传统手动细胞计数，具有计数速度快、准确度高、数据详尽、结果可追溯等优势，大大提升细胞计数的效率，而同比市面其他同类产品，它的数据一样准确可靠，结构更加简单结实、小巧紧凑，而且仪器和耗材的成本也更适合国内主流用户的情况。

如果您对细胞计数仪MCA30有兴趣，欢迎咨询，我们将竭诚为您服务！

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来源：https://www.mshot.com/article/1400.html