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在生命科学领域中，包涵体复体的研究占据了重要的地位。但随着研究的深入，一些问题逐渐浮现。本文将对包涵体复体研究中常见的挑战进行解析，以及为研究者提供一些解决思路。

①包涵体复性原则：

低浓度，平缓梯度，低温。

②怎样洗涤包涵体？

通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。

③对于尿素和盐酸胍该怎么选择

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

④8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

在4度放置半个月，都没什么问题 。在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理BI溶液比较好。

⑤复性时的蛋白浓度

一般使用浓度为0.1-1.0mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

⑥蛋白复性后浓度低

蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。

可以将复性好的蛋白浓缩一下泡胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白，需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出来，复性后的蛋白高速离心看看。

⑦复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。

复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。

若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；

另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。

⑧复性效果的检测

根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

⑨变性的融合蛋白可以制备多抗或者单抗吗？

变性蛋白只是天然蛋白伸直的产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

⑩纯化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？

免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。

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硫氧还蛋白（Thioredoxins）是一系列广泛存在于生物体内的氧化还原酶，它能通过置换硫代二硫化物来减少二硫键的结合。常用作融合表达标签的硫氧还蛋白A(TrxA), 分量为11.6kDa，来源于大肠杆菌。

TrxA标签最独特的优点是它的热稳定性。TrxA本身不作为亲和标签来进行重组蛋白优化，而是通过在高温条件下将杂蛋白变性去除而重组蛋白得以保存。TrxA也具有极好的促溶效率，用作促溶标签时可将重组蛋白的可溶性表达从12%提高至95%。

下面是针对trx标签常见问答解析：

①trx标签蛋白序列

MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA PILDEIADEY QGKLTVAKLN IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL KEFLDANLAG SGSGHMHHHH HHSSGLVPRG

②带有trx标签会不会影响蛋白的抗原性

有可能的，trx标签是比较大的融合标签，有20多KDa，非常有可能改变蛋白的抗原决定簇。

一般为了不影响蛋白的功能，会在trx标签和目标蛋白之间加一个酶切位点，比如肠激酶的位点DDDDK，把trx标签去除掉。

③TRX标签蛋白怎么纯化

一般这个载体中都会有His 标签，直接用镍柱纯化即可

④常见的蛋白标签有哪些？有什么特点？

常见的蛋白标签有His-Tag、FLAG-Tag、HA-Tag、Myc-Tag、SUMO-Tag……

His-Tag

主要应用：蛋白纯化优选，也可用于检测。

特点：

• 分子量小，不影响目的蛋白的可溶性、结构和功能。

• 可在非离子型表面活性剂存在/变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时表现突出。

• 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和。

• 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

• 免疫原性相对较低。

FLAG-Tag

主要应用： 广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域，在真核表达系统中表达效率更高。

特点：

• 分子量小，不影响融合蛋白功能，比同类标签更具亲水性。

• 目的蛋白可直接通过FLAG标签进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白且纯化效率高。

• 可以被抗FLAG抗体所识别，便于通过WB、ELISA等方法对含有FLAG标签的融合蛋白进行检测、鉴定。

• 融合在目的蛋白N端的FLAG标签，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。

更多关于蛋白标签详情可以参看：https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag

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　　牛血清实验中常见的问题解析!

　　胎牛血清通常在细胞培养中作为基础生长培养基的添加剂，在细胞培养中，血清供应了丰富的高分子蛋白，低分子量营养物，疏水载体蛋白和其他体外细胞生长必要的成分如激素和粘附因子。同时，胎牛血清可以增加培养基的缓冲能力或中和有毒成分，起到保护细胞的作用。在细胞培养过程中是否选择添加血清，主要根据基础培养基化学成分，培养细胞的类型和培养体系而定。今天天津本生小编给大家分享的是牛血清实验中常见的问题解析!搬起小板凳快来围观吧!

　　血清实验中常见的问题解析：

　　一、 如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损?

　　将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

　　长时间储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。

　　建议血清应保存在-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

　　二、血清中包含絮状沉淀，它们是什么，怎么处理?

　　沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。这是正常特性，不会影响产品性质。要除去沉淀，离心血清(400g，1-2分钟)或者简单的让其沉淀在瓶子底部，将血清小心的转移到另一个无菌瓶里(一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。所以，使用产品时要摇动并加热血清至37℃，沉淀会自然消失。

　　三、 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗?

　　一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

　　四、 为什么要热灭活血清?

　　加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学 研究，培养ES细胞、平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

　　五、 有必要做热灭活吗?

　　实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

　　而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显着的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点"，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物 的分裂扩增。

　　非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!

　　六、细胞培养 中出现黑点是污染吗?如何处理?

　　一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。

　　七、小牛血清和胎牛血清有何区别与注意事项?

　　来源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。

　　组份与比例不同：两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同，用途与用法不同：某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可，使用浓度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的浓度在20%。

　　血清保存和使用须注意：血清应保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超过一个月。

　　解冻血清时 ，应先将血清至于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，绝对不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中，如放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也会增加，血清在解冻和热灭活后，应按用量分装并于-20℃保存，避免反复冻融。

　　牛血清实验中常见的问题解析!我司由具有行业背景和丰富市场经验的业人士组成，于为生命科学研究域提供产品，为广大科研工作者提供服务。 既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。

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　　1. 保存血清的方法?

　　建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

　　2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?

　　建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

　　3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?

　　血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

　　4. 为什么要热灭活血清?

　　加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

　　5. 有必要做热灭活吗?

　　实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

　　6. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

　　胎牛血清没有预老化，储存在2–8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在–20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

　　7. 如何避免沉淀物的产生?

　　解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

　　注：仅供参考，转载请注明!

一、概述（Summary）

接触角（Contact angle）是指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线，此切线在液体一方的与固-液交界线之间的夹角θ，接触角测量是现今表面性能检测的主要方法。

表面接触角测试仪是采用光学成像的原理，设备采用图像轮廓分析方式测量样品表面接触角、润湿性能、表界面张力、前进后退角、表面能等性能，设备采用全自动进液装置，性价比高、拓展性强、功能全面、可满足各种常规测量需求，目前已经广泛使用在众多高校院所及企业。

HARKE-SPCA粉体接触角测量仪产品参数

l  样品台尺寸:100mm*120mm

l  接触角测量范围：0-180°

l  接触角测量精度：±0.1°

l  接触角显示精度：±0.01°

l  表面/界面张力测试方法：悬滴法

l  表面/界面张力测试范围：0-1000mN/m

l  光学系统：ZF-180高清晰卡位变倍镜头

l  视频系统：USB2.0摄像机+PC软控30帧/秒（可选100帧/秒、300帧/秒、1000帧/秒或更高）

l  仪器外形尺寸：260mm*700mm

l  镜头移动行程：120mm

l  仪器重量：约30Kg

l  测量软件：HARKE-SPCA1.0

l  电源：220V/3A/50Hz

l  测量温度：室温

l  表面能测试方法：EOS

l  测量方法：圆环法、椭圆法、小液滴法等

HARKE-SPCA粉体接触角测量仪基本功能

l    手动精密注液

l    EOS固体表面自由能提供

l    HARKE-SPCA1.0版接触角测量仪软件