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　　2010年5月28日 马萨诸塞沃尔瑟姆 - 专注于提高人类健康及其生存环境安全的lingxian公司PerkinElmer, Inc., 今天宣布为新药开发和生物研究中的高含量筛选应用增添 3D 图像分析功能，该功能集成了本公司Z新版本的旗舰成像软件套件 Columbus 2.1 和 Volocity 5.3.2。

　　科研人员首次尝试将这两款功能强大的平台集成到一起，满足他们在高含量筛选应用中对 3D 成像分析日益增长的需求。先进的 3D 功能可以更清晰和更准确地观察细胞，及其与病原体或ZL化合物的相互作用，从而促进新药开发，帮助科研人员更好地了解细胞生物学。

　　Columbus 平台是一个可联网的开源式高容量图像数据管理和分析系统，它可以导入、导出、存储和管理各种不同格式、不同来源的图像元数据。Volocity 系统是 PerkinElmer 的高性能 3D 成像软件，它可以对图像执行采集、显示、定量和恢复等操作。

　　面临的问题：科学家们在科学研究中不断生成大量图像数据，如何对这些数据进行有效的管理和分析，是他们当今面临的巨大难题。

　　解决方案：新版本的 Columbus 和 Volocity 软件在这两款强大的软件工具之间架起一座桥梁。

　　具体方法：Z新版本的 Volocity 支持 Columbus 服务器，通过简便的拖放界面将 Columbus 中高含量筛选试验结果传输到 Volocity，进行强大的 3D 分析。

　　优点：研究人员现在可以将图像从 Columbus 传输到 Volocity 进行 3D 分析，然后再次返回到 Columbus 进行图像数据的存储和管理。

　　Columbus 2.1：速度提高 10 倍，因此能够处理 Volocity 分析过的海量图像文件

　　Volocity 5.3.2：目前支持 Columbus 服务器，能够在 Columbus 和 Volocity 之间进行方便的拖放链接操作。

　　关于 PerkinElmer, Inc.

　　PerkinElmer, Inc. 是一家专注于提高人类健康及其生存环境安全的lingxian公司。据报道，该公司 2009 年收入为 18 亿美元，拥有约 8,800 名员工，为超过 150 个国家/地区的客户提供服务，同时该公司也是标准普尔 500 指数的成员。

　　有关其它信息，请致电800-820-5046 或 +86(0)21-38769510 或 访问www.perkinelmer.com.cn。

类器官模型因其能够再现真实组织的复杂性而在基础研究、精 准医疗、药物研发等领域都显示出巨大的应用潜力，为疾病建模和化合物影响评估提供了一个非常有用的工具。基于高通量和多参数的全自动成像系统也越来越多应用于类器官表型变化的定量分析。

此次 Webinar 将介绍类器官培养方法和最 新研究进展，同时也会介绍常见的类器官成像等 3D 检测分析技术及相关应用。

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直播时间：7 月 4 日 19:00

19:00 - 19:40

肿瘤类器官疾病模拟与药物评测

由弘浩  高级类器官应用工程师

bioGenous 伯桢生物

内容介绍：肿瘤类器官可作为直接的疾病模型，已被广泛应用在肿瘤发生、发展、药物评价等研究和研发中。报告围绕肿瘤类器官在疾病模拟、药物评测、技术标准、类器官培养等类器官的研究及研发成果进行分享和探讨。共享类器官模型价值，推进类器官的研究转化应用。

19:40 - 20:20

类器官自动化完整解决方案及高内涵 3D 成像分析

安淼 应用科学家

Molecular Devices

内容介绍：类器官的成像和分析是其应用瓶颈之一。而高内涵成像技术能帮助我们更好地获得类器官实验结果，在分享中着重介绍了如何应用高内涵技术获得更好的类器官定量数据，自动化类器官完整解决方案及最 新的 AI 图像分析技术如何帮助我们分析类器官。

讲师介绍

由弘浩，现任伯桢生物高级类器官应用工程师，负责类器官培养售后技术支持工作，拥有 3 年类器官培养技术支持工作经验。

安淼，北京大学理学硕士，现担任 Molecular Devices 公司华南区应用科学家，负责高内涵成像产品线及酶标仪产品线的售前、售后技术支持工作，拥有 5 年高通量检测相关经验。

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直播时间：7月4日 19:00
 

讲师介绍：

由弘浩，现任伯桢生物高级类器官应用工程师，负责类器官培养售后技术支持工作，拥有3年类器官培养技术支持工作经验。

安淼，北京大学理学硕士，现担任Molecular Devices 公司华南区应用科学家，负责高内涵成像产品线及酶标仪产品线的售前、售后技术支持工作，拥有5年高通量检测相关经验。

更优质的图像数据和更可靠的结果

有助于生命科学研究人员更深入地了解疾病

专注于提高人类健康及其生存环境安全的lingxian公司 PerkinElmer Inc. 今天宣布推出专为高内涵筛选 (HCS) 而打造的 CellCarrier? Ultra 384 孔微孔板。该孔板设计经过改进，可在 HCS 应用（例如表型筛选和三维疾病模型研究）中获得更高质量的图像数据和更可靠的结果。这种功能组合让研究人员能够更深入地了解疾病，有助于加速更为GX的新型疗法的研发。

“PerkinElmer 在 HCS 仪器与消耗品方面拥有深厚的专业背景，有助于我们利用指示人体生理学状况的生理相关疾病模型，为希望以无偏差且具有统计学意义的方式测定细胞内变化的科学家开发创新型解决方案。”PerkinElmer 生命科学与技术部总裁 Brian Kim 说道，“诸如此类微孔板的创新为科学家配备了强大的研究工具，让他们可以更加准确地对疾病进行深入分析，从而开发出更为有效的新型ZL方案。”

CellCarrier? Ultra 384 孔微孔板专为在高内涵筛选应用中获得更高性能而设计，而在该应用中成像表面对于高分辨率图像和高质量数据的生成而言至关重要。此孔板拥有黑色外观，经精密设计，其表面极其平整，可实现GX成像。孔板采用环烯烃制成，这是一种光学性质与玻璃类似的塑料，能提供更为清晰的图像。

微孔板的其他功能包括：采用高数值孔径水浸式透镜并结合超低孔板底部时能够更好地观察孔、经过改进的板盖设计可减少蒸发、拐角预留空间可在堆叠时避免损坏成像表面、提供多种包被选择以适应具体应用。

此微孔板是 PerkinElmer 高内涵筛选完整解决方案的一部分，该解决方案包括：Operetta? 高内涵成像系统、Opera? Phenix? 高内涵筛选系统、Columbus? 图像数据管理和分析系统以及 HC Profiler?。

有关 PerkinElmer Cell Carrier Ultra 384 孔微孔板的详细信息，请单击此处。

PerkinElmer, Inc. 是一家专注于提高人类健康及其生存环境安全的lingxian公司。据报道，该公司 2013 年收入约为 22 亿美元，拥有约 7,600 名员工，为超过 150 个国家/地区的客户提供服务，同时该公司也是标准普尔 500 指数的成员。有关其它信息，请致电 1-877-PKI-NYSE 或访问 www.perkinelmer.com。

摘要：

哺乳动物出生后心脏生长的方式由心肌细胞增殖逐渐转变为心肌细胞肥大，成年心脏受损后心肌细胞增殖不足以弥补丢失的心肌细胞，所以探究心肌细胞增殖机制对于受损心肌补充新的心肌细胞至关重要。磷酸化组蛋白 H3 (pH3) 在细胞有丝分裂过程中高表达，作为一种核分裂标志物，是检测心肌细胞增殖的常用指标。高内涵筛选分析技术是一种能够进行荧光显微成像和定量图像分析的自动化高通量筛选技术，能够将所得实验数据进行量化，更加清楚明了展现实验结果。在这里，我们使用高内涵筛选分析系统分析 pH3+ 阳性心肌细胞数量，以评估心肌细胞增殖的程度。

材料与试剂

1. 1 天、30 天龄 C57BL/6J 小鼠（维通利华）

2. 湿盒

3. 组化笔（abcam, catalog number: ab2601）

4. 盖玻片（世泰，catalog number: 10212450C）

5. 粘附载玻片（世泰，catalog number: 188105）

6. 组织包埋盒（世泰，catalog number: 31050102w）

7. PBS 缓冲液粉末 pH7.3（中杉金桥，catalog number: ZLI-9062）

8. PBS 缓冲液 pH7.4（gibco, catalog number: C10010500BT）

9. 4% 多聚甲醛（LEAGENE, catalog number: DF0135）

10. 50X EDTA 抗原修复液（LEAGENE, catalog number: YB-23522-1）

11. DEPC 水（LEAGENE, catalog number: NR0001）

12. Tween 20（Biofroxx, catalog number: 1247ML500）

13. 山羊血清封闭液（中杉金桥，catalog number: ZLI-9056）

14. Trito x-100 破膜液（Sigma-Aldrich, catalog number: X100）

15. 抗体稀释液（中杉金桥，catalog number: ZLI-9030）

16. pH3 抗体（Millipore，种属反应性：小鼠，人，catalog number: 06-570）

17. α-actinin 抗体（Abcam，种属反应性：小鼠，大鼠，人， catalog number: ab9465）

18. Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光抗体（Invitrogen, catalog number: A21206）

19.  Alexa Fluor 594 羊抗鼠免疫荧光抗体（Invitrogen, catalog number: A21203）

仪器设备

1. 全自动组织脱水机（Leica, catalog number: ASP300S）

2. 包埋机（Leica, catalog number: EG1150H）

3. 石蜡切片机（Leica, catalog number: RM2235）

4. 展片机（Leica, catalog number: HI1210）

5. 烤片机（Leica, catalog number: HI1220）

6. 全自动染色机、封片机（Thermo Fisher Scientific, catalog number: ClearVue+ Gemini）

7. 超纯水设备（Thermo Fisher Scientific, catalog number: 50136146）

8. 电磁搅拌器（IKA, catalog number: MS100）

9. 脱色摇床（海门麒麟医用仪器厂，catalog number: TS-2）

10. 涡旋振荡器（Scientific Industries, catalog number: SI-0256）

11. 台式高速冷冻离心机（Eppendorf, catalog number: 5804R）

12. 移液器（Eppendorf）

13. 普通 4 °C 冰箱

14. 共聚焦显微镜（Zeiss, catalog number: LSM 800）

15. 高内涵筛选分析系统（Molecular Devices, catalog number: ImageXpress Micro）

软件

1. ZEN

2. MetaXpress

实验步骤

一、石蜡切片的制备

1、1 天、30 天龄的 C57BL/6J 小鼠购买自北京维通利华公司；

2、1 天龄小鼠置于冰上麻醉 2 min，30 天龄小鼠按照 0.2ml/20g 注射浓度为 17.5 μg/ml 的三溴乙醇溶液进行麻醉。剪刀剪开小鼠胸腔部分皮肤和皮下组织肌肉层，镊子撑开胸腔，迅速剪下心脏和流出道置于预冷的 PBS 缓冲液中，剪掉血管连带的多余组织，排出心脏中的血液；

3、4% 多聚甲醛中固定心脏组织。1 天龄小鼠心脏组织固定 24 h，30 天龄小鼠心脏组织固定 48 h。固定结束后将心脏组织置于包埋盒中在流动水下冲水，去除心脏组织中的多聚甲醛液体；

4、依据心脏组织大小使用全自动脱水机的不同程序进行脱水，样本依次置于 75%、85%、95% 和无水乙醇中，随后在二甲苯中透明，最 后置于 60 °C 液态石蜡浸泡；

5、使用石蜡包埋机将心脏组织按照胸腔中心脏位置摆放，利用石蜡将心脏组织固定于包埋盒中；

6、蜡块置于冰冻机冷冻 1 小时，展片机预热温度至 45 °C，使用 Leica 石蜡切片机切至心脏最 大面，使得心脏腔室完全暴露（图 1），随后按照 5 μm 厚度进行切割，使得组织切片完全粘附于载玻片，待用。

二、免疫荧光染色

1、组织粘附的载玻片置于烤片机上 68 °C 烘烤 45 min ，防止 脱片；

2、载玻片依次放入二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 中各 10 min ，乙醇浓度为 100%、95%、80%、75%、50% 中水化 5 min ，蒸馏水洗 5 min ；

3、提前配制 1× EDTA 抗原修复液（pH=9.0）于高压锅内煮沸，将心脏组织切片放入高压锅中，使得修复液完全覆盖组织切片，高温修复 2 min ，流动水下冲洗冷却 20 min ；

4、PBST 缓冲液冲洗 5 min ，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5 min ，3 次；

5、配制 0.3% 封闭通透液滴加在心脏组织切片上，室温孵育 1 h ；

6、抗体稀释液稀释 pH3 一抗与 α-actinin 一抗滴加到切片组织表面，4 °C 过夜；

7、一抗孵育 16 h 后，室温复温 1 h ；

8、PBST 缓冲液冲洗 5 min ，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5 min ，3 次；

9、按照 1:400 比例使用 PBS 稀释 Alexa Fluor 594 羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光二抗，适量滴加于心脏组织切片上，室温避光孵育 1h；

10、PBST 缓冲液冲洗 5min ，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5min ，3 次；

11、含 DAPI 的封片剂进行封片，注意封片时不能有气泡产生。

三、荧光共聚焦显微镜成像

使用荧光共聚焦显微镜进行成像（图 2）。

四、高内涵筛选分析系统图像采集

采用 High Content Image Processing Software 进行图像采集（图 3），流程如下：

1、使用无水乙醇将玻片擦拭干净，晾干后置于高内涵筛选分析系统中进行图像采集与分析；

2、打开 MetaXpress 5.1 软件，选择 10 倍物镜，根据采集对象选择单个玻片采集；

3、每个心脏组织框选 18 × 18 个视野，我们选择 DAPI、FITC、Texas Red 三个荧光通道，选取一个视野调整荧光通道参数；

4、动态拍照状态下选择采集区域；

5、采集图像。

五、高内涵筛选分析系统数据分析

选择采集的图像荧光信号（图 3），选择一个视野分别对三个荧光通道进行参数调整， 首先调整“All nuclei”荧光强度圈选出 DAPI 标记的细胞核，其次根据“GFP”荧光强度圈出 pH3+ 表达位点，最 后根据“Texas Red”圈出 α-actinin 标记的心肌细胞（图 4）， 统计细胞核中表达 pH3 的心肌细胞数量即为增殖的心肌细胞数量（图 5）。

结果与分析

1、HE 染色展示石蜡切片机切至心脏最 大面，心脏四腔室完全暴露（图 1）。

图 1.HE 染色展示心脏石蜡切片最 大面

2、使用共聚焦荧光显微镜对心脏组织切片进行成像，Z 轴扫描显示 pH3 与心肌细胞细胞核共定位（图 2）。

图 2.荧光共聚焦显微镜成像

哺乳动物出生后 1 周心肌细胞退出细胞周期（Alkass et al.,2015），因此，在小鼠出生后 1 天心肌细胞增殖旺盛，pH3+ 细胞数量较多；而小鼠出生 30 天心肌细胞几乎不再增殖，pH3+ 心肌细胞无法被检测到。

3、高内涵筛选分析系统分别采集心脏组织切片中 DAPI、FITC、Texas Red 荧光标记的图像流程及采集的荧光信号。按照图 3A 所示流程依次设置图像采集区域，分别将 DAPI 标记的细胞核、pH3 标记的增殖点、α-actinin 标记的心肌细胞荧光信号调至清晰焦面。

图 3. 高内涵筛选分析系统图像采集流程及采集荧光图像。A.图像采集流程界面；B.DAPI 标记的细胞核；C.pH3 标记的增殖细胞；D. α-actinin 标记的心肌细胞；E. 三通道叠加。

4、分析采集图像的荧光信号。

在图 4 中，选择一个图像视野，分别圈出 DAPI 标记细胞核、pH3 标记细胞增殖点、α-actinin 标记心肌细胞的荧光信号。如上图所示，A（左）为分析 DAPI 标记荧光信号的参数设置，A（中）为 DAPI 标记荧光信号的采集图像，A（右）为分析 DAPI 标记荧光信号的圈选区域；B（左）为分析 pH3 标记荧光信号的参数设置，B（中）为 pH3 标记荧光信号的采集图像，B（右）为分析 pH3 标记荧光信号的圈选区域；C（左）为分析 α-actinin 标记荧光信号的参数设置，C（中）为 α-actinin 标记荧光信号的采集图像，C（右）为分析 α-actinin 标记荧光信号的圈选区域。

图 4. 荧光信号图像数据分析设置。DAPI 荧光信号数据分析；B. pH3 荧光信号数据分析；C. α-actinin 荧光信号数据分析。

5、所采集图像的荧光信号分析结束后，系统自动计算 pH3+ 心肌细胞数量所占比例， 格式如下：

采集图像的荧光信号分析结束后，根据 DAPI、FITC、Texas  Red 三通道定位情况，计算细胞核中表达 pH3 的心肌细胞数量，得出如图 5 所示的结果。“Subtotal Profile 1XX”表示 DAPI 染细胞核的数量为 1156 ，“Subtotal Profile 12X”表示 DAPI 与 pH3 共定位的细胞数为 18 ，“Subtotal Profile 1X3”表示细胞核完整的心肌细胞数量为 103 ，“Subtotal Profile 123”表示细胞核表达 pH3 的心肌细胞数为 9 ，则增殖的心肌细胞比例为表达 pH3 的心肌细胞数量与所有的心肌细胞数量之比。

图 5. 高内涵筛选分析系统分析数据结果格式

溶液配方

1、1× EDTA 抗原修复液

将 50× 的 EDTA 抗原修复液 20 ml 加入到 980 ml 超纯水中配制为 1× EDTA 抗原修复液待用；

2、0.3% 封闭通透液

将 3 μl Trito x-100 破膜液加入到 1 ml 山羊血清封闭液中配制为 0.3% 封闭通透液；

3、PBST 缓冲液

将 23 g PBS 粉末加入到 2 L 超纯水中，搅拌至粉末全部溶解，液体澄清，为 PBS 缓冲液；将 2 ml Tween-20 加入到 PBS 缓冲液中，搅拌至澄清，为 PBST 缓冲液。

致谢

感谢中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重 点实验室高精光学技术平台老师的大力支持。感谢国家自然科学基金面上项目（NO. 81770308）基金资助。该实验方案已在 Li et al. (2020)、Wang et al. (2020) 等人发表文章中使用。

引言

新陈代谢是生物体内进行的化学变化的总称，是生物最基本的生命活动过程。细胞从环境汲取能量、物质，在内部进行各种化学变化，维持自身高度复杂的有序结构，保证生命活动的正常进行。作为细胞的“能量工厂”，线粒体在维持能量稳态方面发挥重要作用，可以调控蛋白质、脂质、溶质和代谢物产物的进出，并保护细胞质免受有害线粒体产物的影响。线粒体通过不断的分裂和融合，维持线粒体形态、分布和数量，维持细胞稳态，该过程被称为线粒体动力学。线粒体自噬是机体清除细胞内功能异常的线粒体的过程，是线粒体质量控制的主要机制。线粒体动力学的病理改变可导致生物能量功能受损和线粒体介导的细胞死亡，并与多种病理机制相关，包括缺血性心肌病，糖尿病，肺动脉高压，帕金森氏病，亨廷顿氏病，骨骼肌萎缩症、阿尔茨海默病等。

线粒体大小和形状取决于它们在细胞内的位置以及不同细胞对能量的需求。当线粒体发生损伤时，它的形态和完整性会发生改变，如线粒体的数量、大小、长度和形状等。线粒体形态、结构和功能的检测对于了解线粒体的稳态以及功能状态有重要意义。

高内涵成像分析系统非常适合进行线粒体表型和结构的研究。共聚焦成像和水镜可以提高成像质量并更好地显示线粒体结构，高内涵的图像分析工具可以帮助科研工作者获得不同表型的数字特征，线粒体表型和结构重排的分析模块可用于线粒体动力学为基础的细胞研究。

结果展示

使用不同浓度的化合物，包括氯喹（抑 制线粒体循环），鱼藤酮（氧化磷酸化抑 制剂）和缬氨霉素（钾离子载体）处理 PC12（人神经母细胞瘤细胞）。将活细胞用线粒体染料 MitoTracker Orange  和 Hoechst 进行染色，利用 ImageXpress Micro Confocal 系统（Molecular Devices）进行成像，使用共聚焦模式和 40X 水镜拍摄活细胞的图像，分辨单个线粒体并检测线粒体形态变化。使用 MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件中的 Custom Module Editor（自定义模块编辑器）分析图像，使用“Granularity”模块和“Find Fibers”模块识别圆形颗粒和细长的线粒体（图 1）。

图 1 .线粒体形状的表型分析。

Molecular Devices 高内涵成像分析系统适用于各种细胞模型中化合物的药物开发或毒性评估。不同化合物处理会导致线粒体形态变化，膜电位的损失、以及细胞的程序性死亡等。MetaXpress 软件非常适合进行线粒体形态的测定，可以定义每个对象的数量、面积、强度、长度和形状（表1，2）。使用具有共聚焦模式的 40X 水镜对细胞进行成像，MetaXpress 自定义模块编辑器分析图像（图 2）。这些检测结果可以计算剂量反应和各种化合物的有效浓度，以及用数字来表征线粒体结构动力学（图 3）。

图 2 .化合物对线粒体的作用。使用MitoTracker Orange对线粒体进行染色（ 黄色 ），对照组（A）、缬霉素（B）、鱼藤酮（C）。

使用特定浓度的化合物（氯喹，鱼藤酮和缬氨霉素）处理 PC12 细胞，对细胞进行染色和成像。通过图像分析将线粒体结构确定为“纤维”（顶部）或“颗粒”（中部），底部为线粒体染色后荧光强度的变化。EC50的值取决于四个浓度依赖性复本和参数曲线的拟合（图 3）。

图 3 .使用氯喹（绿色），鱼藤酮（红色）和缬氨霉素（蓝色）处理 PC12 细胞。EC50的值取决于四个浓度依赖性复本和参数曲线的拟合。

在分析过程中，我们比较了水镜和空气镜对图像质量和分析的影响。结果显示，使用水镜可以提高图像质量，并且通常会导致 Z' 值增加（ 表 3 ）。图 4 显示了使用自定义模块编辑对线粒体表型进行计数和分析，以评估线粒体的健康、代谢、循环、复合效应和疾病状态等。并且，自定义模块编辑可以针对特定的细胞类型或疾病模型进行进一步的调整和修改。

表 1 .用图 3 所示的曲线定量 EC50。

表 2 .不同的对照和化合物处理方法的比较。上面四列数据分别是对照，10 um 的氯喹，300 nm 的鱼藤酮，和 10 nm 的缬氨酸霉素。

表 3 .与空气镜相比，水镜可以提高图像质量，获得更高的Z’值。

图 4 .自定义模块编辑器（CME）。

总结

Molecular Devices 高内涵成像分析系统适用于各种细胞模型中化合物的药物开发或毒性评估。使用高内涵成像和高级图像分析的线粒体动力学分析方法不仅可以量化线粒体的表型变化，而且这种多参数方法也可用于研究正常和病理结构变化以表征疾病模型或复合效应。

 主要特点 

• 获得高质量的图像，更好地显示线粒体形状和结构的变化

• 以更有效、更精确的方式量化和测量线粒体的表型变化

• 了解疾病的机制并评估各种细胞模型中的化合物毒性

参考文献：

[1]. Gottlieb RA, Bernstein D. Mitochondrial remodeling: Rearranging, recycling, and reprogramming. Cell Calcium, 2016, 60(2): 88–101.

[2]. Yoon Y, Krueger EW , Oswald BJ , et al. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Molecular & Cellular Biology, 2003, 23(15):5409-5420.

[3]. McLelland GL, Soubannier V, Chen CX, et al. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. Embo Journal. 2014, 33(4):282-295.

[4]. Twig G, Elorza A, Molina AJ, et al. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. Embo Journal. 2008, 27:433–446.

[5]. Longo DL , Archer SL . Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. New England Journal of Medicine, 2013, 369(23):2236-2251.

[6]. Qi X, Disatnik MH, Shen N, et al. Aberrant mitochondrial fission in neurons induced by protein kinase C{delta} under oxidative stress conditions in vivo. Molecular biology of the cell. 2011, 22(2):256–265.

[7]. Yu T, Sheu SS, Robotham JL, Yoon Y. Mitochondrial fission mediates high glucose-induced cell death through elevated production of reactive oxygen species. Cardiovascular Research. 2008, 79:341–351.

[8]. Ong SB, Subrayan S, Lim SY, et al. Inhibiting Mitochondrial Fission Protects the Heart Against Ischemia/Reperfusion Injury. Circulation, 121(18), 2012-2022.

[9]. Suen DF, Norris KL, Youle RJ. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 2008, 22:1577-590.

[10]. Konopka AR, Suer MK, Wolff CA, et al. Markers of Human Skeletal Muscle Mitochondrial Biogenesis and Quality Control: Effects of Age and Aerobic Exercise Training. The Journals of Gerontology. 2014, 69(4):371-378.

三维多细胞类球体（肿瘤球、微球、类器官）可以帮助我们在临床前药物筛选阶段更好地预测多种候选药物的潜在作用。但是，相较于二维单层培养细胞，采用三维培养细胞模型系统进行检测分析则更具挑战性。

一起来看看珀金埃尔默是如何分析3D微组织球三维体积与分区的吧！

3D微组织球的制备和成像过程

使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制备细胞球

在CellCarrier Spheroid表面极低吸附力96孔微孔板（珀金埃尔默公司，货号6055330）中接种 HeLa 细胞，细胞浓度分别为1.25E3、2.5E3与5E3。48小时后，以3.7%甲醇固定，再用DRAQ5™染料对胞核染色。如前文所述，用磷酸化组蛋白H3抗体（西格玛奥德里奇公司，货号H9908）和Alexa 546二抗体（美国生命技术公司，货号A11081）联合标记有丝分裂细胞。为达到快速成像的需求，本实验应用长工作距离物镜，使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。对于高分辨率深度成像试验，本实验将细胞球转入兼容高质量成像CellCarrier 384孔超微孔板（珀金埃尔默公司，货号6057300），然后利用ScaleA2试剂进行透明化处理。

“预扫描（PreciScan）”功能大大缩短图像采集时间并减小数据量

研究人员利用Harmony软件的“预扫描（PreciScan）”功能扫描拍摄所有细胞球的图像。“预扫描（PreciScan）”是一项智能图像采集功能，它可以智能识别确定各孔内目标细胞的x/y坐标位置。通过低倍预扫描、智能联机分析和高倍再扫描，生成目标细胞的高分辨率图像。再扫描可以包含z-stack多层扫描和 / 或时间序列扫描。“预扫描（PreciScan）”功能有效节省了测量和分析时间并减小了数据储存空间（例如，使用20x物镜对在384孔微孔板内培养的细胞球进行观察分析时，预扫描可帮助减少25倍的分析时间和数据储存空间；而使用40x物镜观察时，可减少100倍的分析时间和数据储存空间），Operetta CLS与Opera Phenix系统都配置有这一功能。

利用水浸物镜与光透明化技术优化成像深度

使用水浸物镜，大大提高了成像质量，特别是提升了Z轴分辨率。此外，光透明化处理进一步改善了成像深度。光透明化处理不仅提高了样品内指标的均一性，而且减少了光散射和光学像差。在此基础上，采用长波长染色（如可行）也有利于减少光散射并提高透光率，使更多的激光照射在3D样品上。因此，可显著提升成像深度和信号检测效率。

3D微组织球重构与分析

生成三维或 XYZ 轴图像

生成三维样品的 XYZ 轴或三维图像；

在三维空间中变换样品图像——旋转、缩放或平移；

导出视频——三维重建或涵盖多层平面视图的视频。

定位细胞球与胞核

使用“定位图像区域（Find Image Region）”功能定位整个细胞球；

采用局部光强阈值进行 Z 轴光衰减补偿；

选用一种“定位胞核（Find Nuclei）”方法——专门用于 3D 图像胞核分割。

计算细胞球与胞核三维指标

使用“计算形态特性参数（Calculate Morphology Properties）”工具分析细胞球和球体内单细胞的三维形态特征。

定位有丝分裂细胞

使用“定位胞核（Find Nuclei）”功能，根据局部光强阈值定位有丝分裂、 pHH3 阳性细胞；

使用“裁剪区（Clip Box）”功能生成剖视图，从内部（右侧）观察细胞球。

使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图

进行细胞分区，分析有丝分裂细胞分布情况

计算出每个胞核到细胞球边界的Z短距离；

使用“选择区域”和“选择细胞群”功能，将胞核分成不同区域。可随意调整区域宽度；

分析每个区域有丝分裂细胞数量和空间分布差异，得到各种不同的分析数据（例如，细胞形态参数）。

使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图

基于Harmony4.8软件的整体成像细胞球三维分析方法我们可以检测到细胞球整体的形态学特征和细胞球同心区单细胞特性。采用DRAQ5™染料（红色）和pHH3抗体（橙色）标记细胞球，然后用ScaleA2试剂进行光透明化处理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系统装配的20x水浸物镜（数值孔径1.0）和间距为1µm的 z-stack模块（z轴扫描高度：300µm）记录共聚焦三维图像。Opera Phenix系统的3D成像质量Z佳。经实验发现，Operetta CLS系统在被测HeLa细胞球的成像深度和胞核检测性能方面与之不相上下。此处第4和第5步骤操作仅以Opera Phenix系统成像展示，Operetta CLS系统成像效果与之相当。

参考文献

1. Kriston-Vizi, J., Flotow, H. (2017). Getting the whole picture: high content screening using three-dimensional cellular model systems and whole animal assays. Cytometry, 91: 152–159. doi:10.1002/cyto.a.22907

2. User’ s Guide to Cell Carrier Spheroid ULA microplates. PerkinElmer.

3. Smyrek, I., Stelzer, EH. (2017) Quantitative three-dimensional evaluation of immunofluorescence staining for large whole mount spheroids with light sheet microscopy. Biomed Opt Express, 8(2): 484-499. doi: 10.1364/ BOE.8.000484

4. Hama, H., Kurakowa, H., Kawano, H. Ando, R., Shimogori, T., Noda, H., Fukami, K., Sakaue-Sawano, A., Miyawaki, A. (2011). Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience, vol. 14: 1481–1488. doi.org/10.1038/nn.2928

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6. Letzsch, S., Boettcher, K., Schreiner, A. (2018). Clearing strategies for 3D Spheroids. PerkinElmer Technical Note.

7. Boettcher, K., Schreiner, A. (2016). The benefits of automated water immersion lenses for high-content screening. PerkinElmer Technical Note.

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

       高内涵系统不仅仅适用于各种各样的细胞模型，对各种小型的模式生物也非常友好，通过将这些模式生物放在微孔板中，我们就可以用高内涵系统来拍摄和分析它们。本期，我们将继续介绍高内涵与这些模式生物的故事。

拟南芥

拟南芥为两年生草本，一般可长到7-40厘米，是植物学Z为常见的模式生物。其幼苗、根、茎、叶、原生质体均可在高内涵上进行自动成像和分析。

实验一

高内涵用于研究活体拟南芥全叶组织中膜运输的调节，40倍水浸式物镜对拟南芥叶片进行多层扫描，使用高内涵分析软件Harmony识别膜泡转运体，统计其数目、荧光强度、定位等参数[2]（如下图）。

秀丽隐杆线虫

秀丽隐杆线虫在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病都有非常重要的贡献，成虫体长为1mm，通身透明。一般首先对秀丽线虫进行麻醉，再进行高内涵拍摄。

实验一

分析不同药物处理后秀丽线虫的数量和荧光强度，10倍物镜拍摄多个视野，高内涵分析软件Harmony识别不同线虫，计数并分析线虫的荧光强度[3]（如下图）。

小型藻类

藻类的生长、繁殖与水体环境密切相关，常作为水体污染指示物，用于对水体的实时监测中。小型藻类可放置于微孔板中，通过离心使其贴底，从而进行高内涵的拍摄，根据研究内容不同，一般采用20倍-63倍水浸式物镜进行成像。很多研究中通过对叶绿体的成像来判断藻类的状态，成像过程需要设置针对叶绿素自发荧光特殊的检测方法，即通过设定激发光和发射光，定义一个新的通道（excitation 460-490nm，emission 655-705nm）。

实验一

藻类用于检测水质污染，本研究中，模拟微塑料水质污染，检验裸藻的生长状态，采用20倍水浸式物镜(NA 1.0) 进行成像，绿色为微塑料，红色为叶绿素。（如下图）

生长状态不好的裸藻叶绿素荧光强度减弱，形态发生变化。（如下图）

左图为Harmony软件识别裸藻细胞，中间图为通过形态区分形态正常的梭状裸藻（红色）和因毒性变圆的裸藻（绿色），右图为通过荧光强度区分死亡裸藻（绿色）和存活裸藻（红色）。

参考文献

2.High-throughput confocal imaging of intact live tissue enables quantification of membrane trafficking in Arabidopsis. Plant Physiol. 2010 Nov;154(3):1096-104. doi: 10.1104/pp.110.160325. Epub 2010 Sep 14.

3.Expanding the Biological Application of Fluorescent Benzothiadiazole Derivatives: A Phenotypic Screening Strategy for Anthelmintic Drug Discovery Using Caenorhabditis elegans. SLAS Discov. 2019 Aug;24(7):755-765. doi: 10.1177/2472555219851130. Epub 2019 Jun 10.

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生命科学研究离不开各式各样的模式生物，模式生物由于其结构简单、生活周期短、培养简单、基因组小等特点，在生物医学等领域发挥重要作用。模式生物作为材料不仅能回答生命科学研究中Z基本的生物学问题，对人类一些疾病的ZL也有借鉴意义。常见的模式生物有真菌中的酵母，低等无脊椎动物中的线虫，昆虫纲的果蝇，鱼纲的斑马鱼，哺乳纲的小鼠以及植物中的拟南芥。

高内涵系统不仅仅适用于各种各样的细胞模型，对各种小型的模式生物也非常友好，通过将这些模式生物做一些预处理，放在微孔板中，我们就可以用高内涵系统来拍摄和分析它们。本期和下期，我们将隆重介绍高内涵与这些模式生物的故事。

酵 母

常用于模式生物的酵母有两个物种：出芽酵母和裂殖酵母，以出芽酵母为例，其细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。使用高内涵系统，可以观察和分析酵母的世代周期、蛋白定位等。

实验一

Hoechst 33342 染色酵母活细胞，通过63倍水浸式物镜拍摄酵母细胞，高内涵分析软件Harmony自动识别酵母细胞，PhenoLOGIC人工智能算法区分出芽细胞：

实验二

酵母细胞器相关蛋白的标记，红色标记整个酵母细胞，绿色为不同细胞器，高内涵分析软件Harmony可识别不同的细胞器结构，分析其荧光强度、形态学参数和纹理参数[1]。

下图为突变体中蛋白定位发生变化[1]。

斑马鱼

斑马鱼也是成熟且常见的模式生物，常用于疾病研究中。斑马鱼成鱼体长5cm左右，幼鱼0.5-2cm，全身透明。一般首先对斑马鱼进行麻醉，再进行高内涵拍摄。

实验一

斑马鱼曲度的研究，毒性处理或一些基因突变会导致斑马鱼的曲度发生变化，高内涵分析软件Harmony可分析斑马鱼的轴向长度、曲率、弯曲角度等参数：

实验二

斑马鱼血管研究，斑马鱼全身透明，一直以来都是非常好的心血管研究模式生物，通过20倍水浸式物镜（NA1.0）对斑马鱼血管进行成像，高内涵分析软件Harmony可通过一系列算法识别荧光标记的斑马鱼血管结构，也可对血管结构做3D重构，分析血管长度、荧光强度等参数：

参考文献

1.Yeast Proteome Dynamics from Single Cell Imaging and Automated Analysis. Cell. 2015 Jun 4;161(6):1413-24. doi: 10.1016/j.cell.2015.04.051.

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在任何药物研发进程中，实验方法的设计和优化对新药研发的成功性而言至关重要。我们需要考虑的因素包括：选择Z合适的检测技术，读取模式，和实验模型（生物化学，细胞或动物）。通常，这些因素会影响数据质量，生物相关性以及ZL的可预测性，Z终将影响整个临床前药物开发工作的成败。

方法技术的选择

diyi步是确立解决实验问题的技术，例如激活，YZ或调控靶标、阐明MOA（作用机制）、确定受体 - 配体或蛋白质 - 蛋白质的相互作用、鉴定和定量疾病特异性生物标志物或血浆中的生物标志物成分。

样本基质的兼容性

生物标志物测定旨在检测或定量生物学中的靶标样本(例如，复杂基质）中的含量，这种负责基质涵盖范围有：细胞培养中的分泌蛋白，细胞裂解液，组织提取物，唾液，尿液，血清，血浆，血液的上清液，或其他液体（例如，CSF，BALF）。分析技术可能并非总是如此。某些实验方法在某些基质中存在干扰而不适用。例如，在血清，血浆或血液中的血红蛋白表现出广泛的可见光谱吸光度，即在350和600nm之间。检测方法中，依赖于这些波长的激发或发射将容易发生干扰。基于洗涤的检测方法可以避免由于过多复杂基质引起的干扰，因为干扰物质在洗涤过程中被冲走。为了确定基质的相容性，在合适的稀释液中的加标回收和标准曲线是传统的验证方法。

同时，在复杂体系中的抗体选择也是非常重要的，靶标蛋白可能被修饰或者酶切，影响抗原识别位点，因此，加入蛋白酶YZ剂也是有必要的。

实验效果 ：灵敏度和动态范围

 一个实验的灵敏度决定了其在动态范围内的对其靶点的检测的“分辨率”，同时预警了不同批次批次之间的Z低检测范围的差异性。灵敏度同时也依赖于检测样本。血清中的检测难度高于细胞水平。同时“珍贵样品”如有限的细胞或者组织会决定测试的容许体积等。方法技术也会影响检测灵敏度，如发光和荧光的模式比吸收光的模式的灵敏度要好。

动态范围定义了检测下限和上限。例如下图所示，不同的检测技术对于肿瘤坏死因子TNF的检测动态范围达到了数量级的差异。因此，当样品含量超过了其实验方法的动态范围，其浓度，动力学参数，活性，结合力将不准确。因此，需要预先滴定检测窗口以免达到饱和。

下图展示了不同实验技术对于不同的亲和力的适用范围：

特异性

特异性对于确保筛选靶向的靶点或表型非常重要。对于免疫分析，需要考虑针对靶向分析物特异性的抗体，特别是对于靶向蛋白质的部分修饰新表位变化,结合/未结合或活性/非活性状态。此外，还需要考虑物种和靶点的交叉反应性。

稳定性和准确性

尽管信号强度和和性噪比（S/B）通常被用来评估一个实验的质量，可重复性和准确性也是非常重要的。Z’是一个非常好的评判标准。例如，相对而言，高Z’而低信噪比的实验方法好于低Z’高性噪比的实验方法。与此同时，实验发法应当具有高重复性，定量实验应该有标准品做参照。设置好对照，好的标品，抗体，阳性化合物对于建立可靠的实验是非常重要的。

试剂和其他耗材

对于免疫实验来说，高灵敏度和搞特异性的抗体非常重要，同时还有对应的酶或重组蛋白。通常，所有的实验成分，例如细胞、蛋白、酶、辅因子、底物、激动剂，拮抗剂等都需要进行浓度滴定以确定Z优浓度。该过程能够确保稳定的动力学研究以及防止过饱和浓度而产生的试剂浪费。（如下图）

细胞模型

在选择细胞模型时，应考虑使用原代细胞与重组/永生化细胞系的优缺点，以及研究内源性与重组表达的靶蛋白。同时需要评估目标蛋白的表达水平，因为过多或过少的表达会影响灵敏度和分析质量。细胞传代和培养条件也会影响实验质量。

微孔板的选择

正确选择微孔板可以减少交叉效应、降低背景、降低信号吸收或放大信号强度。下表显示了基于检测方法的微孔板选择矩阵。

众所周知，药物研发花费巨大，耗时长。优化已知影响数据质量、生物相关性和ZL可预测性的实验因素Z终推动整个临床前药物开发工作的成功。选择Z合适的分析技术、读取模式和实验模型以及优化实验方案为成功和经济有效的药物开发奠定基础。

我们珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案。例如，我们拥有的均相的Alpha技术以及TRFRET技术，时间分辨defia技术，化学发光技术，细胞增殖和毒性试剂盒，各类GPCR以及动物模型的探针细胞株，微孔板等试剂耗材，能够助力您新药研发的各个环节。

珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案，欢迎大家关注“珀金埃尔默生命科学”微信公众号了解更多解决方案，期待您的垂询！

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      Extracellular signal-regulated kinase（ERK）是胚胎发生，细胞分化，细胞增殖和细胞死亡调控的关键组成部分。ERK途径起源于质膜中的活化受体，并通过Ras/Raf/MEK至ERK（图1）。

      图1. Ras/Raf/MEK/ERK信号级联将信号从细胞表面受体如EGF受体（EGFR）传播到细胞内蛋白质。ERK是该途径的Z终组分，并且在被生长因子（例如EGF（表皮生长因子））激活后，触发下游效应，如激酶或转录因子的激活。

      该途径被不同类型的受体激活，包括受体酪氨酸激酶 （例如EGF受体）以及G蛋白偶联受体。作为信号传导途径的Z终组分，ERK磷酸化不同的细胞内蛋白质，包括大量其他激酶和转录因子。ERK信号传导途径存在于各种癌症类型中，因此正在研究作为ZL干预的靶标。

      在这里，我们描述了如何在Operetta CLS高内涵分析系统上自动化研究ERK信号传导的活细胞FRET测定。该测定可以用于药物发现。

基于FRET的ERK生物传感器

      FRET是从供体分子到受体分子的非辐射能量转移。能量转移需要供体和受体间隔小于10nm，因此提供了研究分子接近度变化的敏感工具，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用（分子间FRET）或蛋白质的构象变化（分子内FRET）。在这项研究中，我们专注于分子内FRET，使用称为EKAREV的CFP-YFP生物传感器（图2）。稳定表达EKAREV的细胞由Somponnat Sampattavanich博士友情提供（图3）。在该生物传感器中，供体和受体荧光团以单一融合蛋白编码。EKAREV生物传感器经过优化，可以减少随机触发的基础FRET信号，并使其可靠地与距离相关。ERK对EKAREV的磷酸化触发构象变化，使CFP和YFP靠近诱导FRET。

图2.细胞外信号调节激酶活性报告基因（EKAREV）的示意图。在该生物传感器中，两种荧光蛋白通过ERK底物结构域，接头和结合结构域分开。一旦ERK底物结构域经过ERK的磷酸化，就会触发构象变化，使CFP和YFP紧密接近并允许FRET发生。

      EKAREV生物传感器是分子内FRET的实例，其中供体和受体以1：1的固定化学计量存在。因此，进行双通道比率实验就足够了，通道1检测受体发射光(

IAcceptor)，通道2检测供体发射光(IDonor)，将得到的两个荧光信号强度进行背景校正，并计算它们的比率以给出相对FRET效率EFRET:

测定方法

      将1.2×104EKAREV细胞/孔接种到CellCarrier-96Ultra微量培养板（PerkinElmer＃6055300），150μl培养基（表1）中。孵育2天后（37℃，5％CO2），150μl饥饿培养基洗涤两次并在饥饿培养基中孵育5小时以降低基础ERK活性。另外，在孵育开始时向细胞中加入各种浓度的YZ剂或DMSO。4.5小时后，将细胞核用4μM DRAQ5在37℃，5％CO2下染色30分钟。然后用饥饿培养基洗涤细胞一次，并加入含有8μl 20x浓缩YZ剂或DMSO对照的150μl新鲜饥饿培养基。作为对照，在某一时间点，向细胞中加入8μl20x浓缩诱导物（PMA或EGF）。为了YZFRET信号，应用PD184352，SCH772984和Ulixertinib。含有或不含有所测试化合物的Z高DMSO浓度的培养基用作对照。

试剂，化合物和介质列表

成像

      在宽场模式下使用20x高NA物镜（NA 0.8）在Operetta CLS系统上建立长时间实验，获取图像总共97分钟。将FRET诱导化合物添加到血清饥饿细胞后，开始时间序列，测量间隔为每8分钟一次，在此设置中获得了四个渠道：DRAQ5 （ex 615-645，em655-760），CFP（ex 435-460，em 470-515），YFP（ex490-515，em 525-580）和FRET（ex 435-460，em 515-580）（图3）。

图3.稳定表达EKAREV生物传感器的人乳腺上皮细胞。细胞核用DRAQ5染色。随后，在Operetta CLS系统上使用宽场模式的20x高NA物镜对细胞成像。

分析策略

      使用Harmony®高内涵成像和分析软件进行自动图像分析。简言之，将图像分割成细胞和背景。计算细胞质和背景中的供体和FRET强度，然后计算背景校正的FRET比率作为Z终结果（图4）。

图4.使用Harmony软件进行比率FRET定量的图像分析工作流程：细胞和背景的细胞质被分段，低表达细胞被强度阈值排除。量化供体和FRET通道的强度及其适当的背景，并计算背景校正的FRET强度比。减去背景强度在活细胞应用中尤其有利，其中具有自发荧光组分的培养基通常导致更高的背景并因此导致更小的测定窗口。

结果

为了探索是否可以使用基于FRET的生物传感器在Operetta CLS上研究ERK信号传导的调节，用不同的ERK和MEK激活剂和YZ剂处理EKAREV细胞。（图5）。

图5.外源添加的活化剂（绿色）和YZ剂（红色）示意图及其对ERK信号通路的影响。表达EKAREV的细胞用EGF或PMA处理以诱导ERK活化，另外，用三种MEK和ERK特异性YZ剂（PD184352，SCH772984，Ulixertinib），在途径的不同位置中断信号转导。

      PMA和EGF充当Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的特异性激活剂。EGF特异性结合细胞表面上的EGF受体，而PMA作为亲脂性，膜可渗透的分子通过直接激活RAF激活该途径。PD184352可以通过选择性YZMEK1/2来YZERK途径，而Ulixertinib和SCH772984都是ERK1/2的有效和选择性YZ剂。

      首先，为了更多地了解FRET诱导和YZ的动态性质，记录了97分钟的长时实验。正如所料，与未处理的对照相比，单独用EGF或PMA处理细胞导致FRET比率的强烈增加（图6）。大约30分钟后信号处于高位。对照显示较低水平的ERK活化，并且观察到随时间稳定增加。由于ERK1/2可以通过多种生长因子和有丝分裂来调节，这可能是由活细胞成像过程中的自分泌或旁分泌信号引起的。用不同浓度的ERKYZ剂（SCH772984）共同处理细胞导致ERK反应的剂量依赖性降低。在5μMSCH772984中，通过EGF的ERK活化几乎可以忽略不计，表明在该浓度下ERK被完全YZ。请注意，0.5％DMSO是实验中使用的Z高浓度，确实对FRET比率有影响，因此需要包括此对照。用第二种ERK1/2特异性YZ剂Ulixertinib获得了类似的结果（数据未显示）。

图6.在Operetta CLS系统上使用基于EKAREV FRET的生物传感器的ERK信号传导的时间进程。通过EGF或PMA刺激ERK诱导快速FRET信号增加，在约30分钟后平稳。高浓度的SCH772984（5μM）导致几乎完全YZERK活化（1μg/ ml EGF），没有可测量的FRET信号增加。较高稀释度的SCH772984仅部分YZEGF诱导的ERK活化。control显示没有任何处理的样品有中间轻微上升的FRET信号。0.5％DMSO略微YZFRET信号，这是实验中使用的DMSO的Z高浓度。测定统计：Z'= 0.87（在时间点32分钟计算，DMSO为阴性，EGF为阳性对照）

      当FRET信号在32分钟后达到恒定水平时，选择该时间点以确定SCH772984的IC50值。用1μg/ mL EGF和系列稀释的SCH772984处理EKAREV细胞，稀释范围为10pM至3μM。计算的IC50值为272nM的剂量反应曲线如图7所示。

图7.ERKYZ剂SCH772984导致基于FRET的EKAREV信号的剂量依赖性降低。在1μg/ ml EGF存在下，用递增浓度的SCH772984处理EKAREV细胞。在孵育32分钟后，在Operetta CLS系统上测定FRET比率，因为信号在此时间点稳定。高Z'值（Z'= 0.89）显示出优异的分析性能。

      为了研究EKAREV FRET成像测定是否可用于研究直接作用于MEK1/2的途径调节，测试了MEK1/2YZ剂PD184352对PMA化细胞的作用（图8）。如图所示，PD184352YZPMA诱导的ERK活化。

图8.在Operetta CLS系统上测量的PD184352对PMA活化的Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的YZ。EKAREV细胞用另一组活化剂和YZ剂（PMA+PD184352）处理，其作用在RAF/MEK的上游（与图5比较）。用200或2000nM PMA处理的EKAREV细胞显示出高FRET反应（诱导后32分钟）。通过将细胞与MEK1/2特异性YZ剂PD184352以10μM的浓度共孵育来YZ活化。

结论

      EKAREV FRET生物传感器可用于Operetta CLS系统的活细胞成像测定，以研究ERK的激活和YZ。级联内不同靶标的调节很容易测量，因此这种方法可以有助于鉴定干扰Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的新化合物。该测定在活细胞中进行，因此它可用于分析ERK信号传导动力学，而定量ERK磷酸化的常规生物化学技术通常是终点测定。尽管细胞群中生物传感器表达水平相对不均匀（图3），但FRET比率的计算提供了特别好的化验数据和统计数据，Z'值高于0.87。

      EKAREV生物传感器的优化设计，Operetta CLS系统的高质量成像以及Harmony内图像分析的出色工具都有助于提高这里提供的高含量FRET分析的稳定性。Harmony软件的构建模块概念允许创建易于设置和理解的图像分析序列，并且不需要专业的图像分析知识。该测定还提供了Opera Phenix™高含量筛选系统的可比较结果和测定统计数据。由于Operetta CLS和Opera Phenix系统比传统显微镜具有更高的通量，基于FRET的生物传感器的高含量成像为药物发现和细胞信号传导中的基础研究开辟了新的可能性。

参考文献

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3. McCubrey, J. A, Steelman, L. S., Chappell, W. H., Abrams,S. L., Wong, E. W. T., Chang, F., Lehmann, B., Terrian, D.M., Milella, M., Tafuri, A., Stivala, F., Libra, M., Basecke, J.,Evangelisti, C., Martelli, A. M., and Franklin, R. A. (2007):Roles of the Raf/ MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochimica et Biophysica Acta, 1773,

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毒性蛋白质病(Proteinopathy)通常由细胞内或细胞外沉积大量折叠变异的蛋白质(Misfolded protein)所致。在蛋白合成和成熟过程中的任何一个环节出现问题，如蛋白突变、折叠以及翻译后修饰出现异常都有可能会导致蛋白质病的发生。虽然蛋白质病这个术语对很多人来说还比较陌生，但现已证明其和多种严重的神经性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的发生密切相关。靶向蛋白质病的研究也为屡屡受挫的神经退行性疾病ZL提供了新的曙光[1,2]。

高内涵整体解决方案的优异体现

在七月的Cell主刊中，研究将目光转至由MUC1基因移码突变导致的肾病(MUC1 kidney disease ,MKD)[3]。与神经性退行性疾病类似，MKD目前尚无有效ZL手段。结合细胞系、小鼠模型、病人组织和日益火热的类器官来源样本，研究证实MUC1突变蛋白(MUC1-fs)会大量聚集在细胞内，并Z终激活未折叠蛋白应答(Unfolded protein response UPR)，诱发细胞损伤和毒性。因此，MKD也属于蛋白质病的一种。针对该发病机制，研究实施基于高内涵平台的高通量筛选，并成功获得能特异清除突变MUC1蛋白的小分子药物BRD4780。该研究不仅深入我们对蛋白转运异常发生机制的了解，也为多种毒性蛋白质病提供了新的ZL策略和切入点。在七月的研究热点版块中，Nature Review Drug Discovery专门针对发现进行了解析[4]。

该研究也体现了珀金埃尔默高内涵整体解决方案的GX应用。成像平台Opera Phenix配合CellCarrier Ultra系列微孔板主导高内涵筛选的同时，并通过水镜优势参与了基于上述四种样本的所有荧光拍摄和动态追踪分析细胞凋亡进程。针对类器官样本的拍摄，PreciScan功能被用于提速拍摄进程和排除不需要的图像采集和分析。所有的荧光分析由Harmony软件完成，尤其是‘spot’分析功能的应用。

a疾病解析

通过MKD病人和体外模型等样本，研究使用抗体染色方式分析野生型MUC1和对应突变产物的组织和细胞分布。在不同来源的样本中，值得一提的是基于病人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells , iPS cells)建立的类器官(Organoid)样本。基于干细胞技术的类器官模型建立和分析也是近年来高内涵的优势应用方向之一[5]。与病人的切片结果一致，野生型MUC1主要分布在类器官的顶膜部位，而突变蛋白则分布在细胞内。进一步研究证明聚集在细胞内的突变MUC1会诱发细胞应激，活化ATF6-UPR通路并Z终导致细胞损伤，表明MKD是蛋白质病。

基于MKD病人的肾类器官模型染色，图片由Opera Phenix拍摄。

红色指示野生型MUC1蛋白；绿色指示突变体MUC1蛋白；蓝色为E-cadherin；黄色为Na/K ATPase标记基底外侧膜。

b高内涵筛选

为了发现能有效清除突变蛋白的药物，研究针对病人样本建立永生化细胞系，并利用Opera Phenix开展大规模、多指标高内涵筛选。在初筛中，研究关注能清除突变蛋白并无显著细胞毒性的药物，并在此基础上细化筛选药物浓度开展二轮筛选。通过两轮筛选后，研究通过特异性、mRNA水平调控和是否能YZER应激药物thapsigargin的细胞毒性三个指标来进一步分析候选药物。

高内涵筛选流程图

Z终，从3713种化合物中，研究成功发现BRD4780满足上述的指标，能有效特异清除突变蛋白的同时不影响MUC1转录水平，并能保护病人模型细胞系不受thapsigargin的应激压力。进一步的实验证明BRD4780能工作于类器官模型和小鼠模型，是非常有潜力的MKDZL药物。

左图：基于细胞系的染色结果，黄色指示野生型MUC1蛋白；绿色指示突变体MUC1蛋白；灰色指示细胞核。

右图：对应的统计分析和细胞数变化分析。

c机制研究

为了解析MUC1突变体亚细胞聚集原理和BRD4780工作机制，研究利用成像技术进行大量共定位研究，并发现病人来源细胞系中MUC1突变体滞留在内质网和高尔基体之间的早期分泌通路中，并与运货受体TMED9有显著的共定位趋势，且这个现象能进一步在多种模型和病人组织中重现。通过动态成像追踪，研究证明BRD4780能将滞留的突变蛋白从早期分泌途径中释放出来，并促进其进入溶酶体降解途径。

基于细胞系的亚细胞共定位研究，分析基于Harmony软件的‘spot’ 分析功能。

基于细胞系、小鼠模型、病人组织和类器官来源样本的荧光染色分析，红色指示TMED9；绿色指示突变体MUC1蛋白；灰色指示细胞核。

* 荧光图片均由Opera phenix 拍摄。

非常有意思的是，在病人样本中研究同时也发现TMED9蛋白水平的上升，而BRD4780处理同样能降低TMED9蛋白水平。此外，通过CRISPR技术敲除TMED9能表型模拟BRD4780的处理效果，清除突变蛋白。因此，TMED9参与了MUC1突变体在早期分泌途径的滞留和积累，并可能是BRD4780的直接作用靶点。针对此，研究采取细胞热移位测定法(Cellular thermal shift assay，CETSA)证实细胞内BRD4708和TMED9存在直接相互作用。凭借其能在生理条件下进行细胞水平分析的优势，CETSA成为了内源蛋白-药物相互作用分析技术的生力军，是表性筛选下游药物解析的利器。

基于CETSA方法在细胞水平确认BRD4708能直接结合TMED9

综合上述的发现，研究向我们阐释了MKD的发病以及BRD4780的作用机制。通过直接结合TMED9，BRD4780将突变的MUC1蛋白从内质网和高尔基体之间的早期分泌通路中释放出来，加速溶酶体对其的清除。令人兴奋的是，在具有很好的药理性质的同时，BRD4780不仅能作用于MKD，还能作用于其他多种膜相关蛋白导致的毒性蛋白质病，如UMOD突变相关的慢性肾病和色素性视网膜炎等，是非常有潜力的候选药物。

MKD的发病机制和BRD4780的作用机制图

同时，该研究也是高内涵两大应用领域的精华案例。首先是亚细胞水平成像应用，研究中涉及到的大量定位、共定位研究和动态追踪蛋白转运过程都是高内涵的优势应用场景。其次，更为关键的是，该研究也是成像筛选主导的药物发现案例。从疾病模型表型的建立到靶向逆转疾病相关表型的筛选，和Z 后下游的药物机制研究，都离不开珀金埃尔默高内涵解决方案。高内涵解决方案，伴随着机器学习的逐渐成熟，将成为创新药物研发行业的新鲜血液[6]。

参考文献

1. Ganguly G, et al.Proteinopathy, oxidative stress and mitochondrial dysfunction: cross talk in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Drug Des Devel Ther. 2017 Mar 16;11:797-810.

2. Scotter EL, et al.TDP-43 Proteinopathy and ALS: Insights into Disease Mechanisms and Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 2015 Apr;12(2):352-63. doi: 10.1007/s13311-015-0338-x.

3. Dvela-Levitt M, et al.Small Molecule Targets TMED9 and Promotes Lysosomal Degradation to Reverse Proteinopathy. Cell. 2019 Jul 25;178(3):521-535.e23.

4. A novel approach to reverse proteinopathies https://www.nature.com/articles/d41573-019-00133-5

5. Czerniecki SM, et al.High-Throughput ScreeningEnhancesKidneyOrganoid Differentiation from HumanPluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping. Cell Stem Cell. 2018 Jun 1;22(6):929-940.e4.

6. Machine learning brings cell imaging promises into focus https://www.nature.com/articles/d41573-019-00144-2

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

转化医学系列网络讲座又来啦！

本期webinar邀请到的是多伦多大学Sunnybrook研究所的李响博士。李博士现就职于David Andrews实验室，研究方向为利用高通量，高内涵筛选药物组合和使用人工智能进行图像的大数据分析。在David Andrews教授的带领下研发临床Chemoresponse Assay，立志于推动个人化jing准YL的临床转化与应用。Chemoresponse Assay目前可以为CLL的生理和病理药物反应提供功能强大、用途广泛的临床检测。接下来将把检测方式应用于AML临床验证。针对固体肿瘤，Andrews团队利用新型化合胶质建立了基于乳腺癌，肺癌病人原发癌细胞的3D类器官配合Chemoresponse Assay的检测筛选。

转化医学系列网络讲座

讲座题目：

高内涵筛选在转化医学与个性化YL领域的应用：化疗药物反应的检测

讲座时间：

8月29日下午14:00-15:00

主讲人：

李响 博士（多伦多大学）

讲座形式：

网络讲座，手机或PC即可参与

（会议链接和如下报名链接相同）

内容简介

本期讲座李博士将结合自己的研究给大家介绍以下内容：

1. 概括介绍目前癌症ZL的方法,利弊和趋势以及对jing准YL的需求。

2. Andrews实验室创立了利用高内涵药物筛选结合机器学习从而对癌症病人化疗药物反应的快速检测：HCS Chemoresponse Assay。

结合目前进行的慢性淋巴细胞白血病CLL临床验证来讲述检测流程和检测原理。

HCS Chemoresponse Assay的优势以及临床实验结果举例。

针对固体肿瘤的肿瘤类器官的建立与HCS Chemoresponse Assay的结合简单介绍。

HCS Chemoresponse Assay在转化医学，药物研发和临床检测的展望。

扫描下方二维码，即刻报名

主讲人简介

李响 博士

Melbourne University墨尔本大学生物医学学士；

Melbourne University Honours墨尔本大学生物医荣誉学士；

Melbourne University-Walter and Eliza Hall institute（WEHI） PhD墨尔本大学-伊莉莎霍尔研究所博士；

University of  Toronto-Sunnybrook Research Institute Post-doctoral fellow多伦多大学Sunnybrook研究所博士后；

博士阶段在WEHI主攻细胞死亡与癌症研究。现就职于David Andrews实验室，研究方向为利用高通量，高内涵筛选药物组合和使用人工智能进行图像的大数据分析。

更多转化医学系列网络讲座安排，具体时间以珀金埃尔默微信推送时间为准。敬请关注！

关于珀金埃尔默：

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摘要：

心脑血管疾病是近 30 年来全 球较高死亡因素，而血栓形成是心脑血管意外的关键病理过程。在血栓性疾病的病理机制研究和新药研发中，对实验模型的血流动态分析极为必要。新兴脊椎动物模型斑马鱼体外发育且早期胚胎透明，并在受精后 24 小时即建立全身血液循环，故成为研究心血管循环相关疾病的理想动物模型。目前，已有较多标记特定细胞类型的转基因荧光鱼被各实验室广泛使用，例如标记红细胞的 Tg (LCR:eGFP) 鱼系，Tg (gata1:eGFP) 鱼系等，使血流动态观测更为便捷。本文集中介绍了如何使用高内涵成像系统对斑马鱼活体胚胎进行血流动态分析，并以苯肼血栓疾病造模为例，为该方法在观测血栓性疾病的应用进行了展示。本方法具有操作简便、通量大、及活体动态观测等优势，可应用于抗血栓药物及相关药物的大规模高通量体内筛选。

研究背景

血栓事件发生率在全 球逐年增加。其中，动脉血栓形成是缺血性心脏病与中风的关键病理机制，而静脉血栓形成可导致静脉栓塞与肺栓塞，是癌症病患中的主要致死因素。抗血栓治 疗主要包括抗凝与抗血小板治 疗。前者代表性药物如肝素、华法林等，主要通过抑 制凝血级联反应中的凝血因子发挥作用；后者则主要作用于血小板活化信号通路中的关键靶点，如环氧化酶抑 制剂阿司匹林通过抑 制血栓素 A2 合成发挥抗栓作用，是心脑血管血栓性事件二级预防的一线用药 (Depta  and  Bhatt,  2015) 。然而，包括阿司匹林在内的抗栓药物仍存在较多临床局限性，如导致消化道出血等，临床使用仍存在争议 (Raber et al., 2019) 。因此，抗栓治 疗领域的新药研发仍是重要研究方向。在血栓性疾病的病理机制研究和新药研发中，对实验模型的血流动态分析极为必要。斑马鱼是新兴脊椎动物模式生物，因其繁殖力强，胚胎体型小且早期透明等独特优势，倍受发育生物学及大规模毒理学及药理学筛选相关研究的青睐。其中，斑马鱼胚胎在受精后 24 小时即建立全身血液循环，且其心血管系统相关信号通路与人类高度保守，故成为研究心血管循环相关疾病的理想动物模型。本课题组前期工作结合红细胞特异性荧光标记转基因荧光鱼，例如 Tg (LCR:eGFP) 鱼系 (Ganis et al., 2012) ，Tg (gata1:eGFP) 鱼系 (T raver et al., 2003) 等，使用苯肼构建血管内皮及红细胞膜损伤相关的血栓疾病模型，对活 血化瘀类中成药中的抗栓活性成分进行了筛选及深入分析 (Sheng et al., 2020；Li et al., 2021) 。实验工作中发现，使用手动式显微镜逐孔视频拍摄，及后期基于视频与其他图像处理软件的红细胞流速定量分析过程对时间与人力成本要求较高，难以适应大规模药理筛选的通量要求。而使用高内涵成像系统，可自动进行拍摄，并通过其配套软件完成血流定量分析，具有操作简便、通量大、及活体动态观测等优势，可应用于抗血栓药物及相关药物的大规模高通量体内筛选。因此本文以苯肼血栓疾病造模为例，介绍高内涵成像在斑马鱼活体胚胎进行血流动态分析相关实验方法，对该方法在观测血栓性疾病的应用进行了展示。

材料与试剂

1. Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼 (Ganis et al., 2012) （购自浙江大学公共技术平台斑马鱼分平台）

2. 苯肼（阿拉丁, catalog number: G1324044）

3. 阿司匹林（碧云天, catalog number: M0119A）

4. 1-苯基-2-硫脲 (PTU) (Sigma-Aldrich, catalog number: 103-85-5)

5. 亚甲基蓝（阿拉丁, catalog number: M19650）

6. 3-氨基苯甲酸乙酯（Sigma-Aldrich, catalog number: MS-222）

7. 二甲基亚砜（阿拉丁, catalog number: D103281）

8. 蛋白酶（Roche, catalog number: 165921）

9.  一次性实验室用塑料吸管（为尔康, catalog number: W208）

10. 96 孔黑板（Corning, catalog number: 3340）

11. E3 胚胎培养液（见溶液配方）

仪器设备

1. 高内涵成像系统（Molecular Devices, model: ImageXpress Micro Confocal）

2. 体式显微镜（麦克奥迪, model: SMZ-168）

3. 微量移液器（德国, model: Eppendorf）

4. 实验用斑马鱼养殖与繁育系统（上海海圣, model: Z-C-D5）

5. 智能生化培养箱（宁波赛福, model: SPX-250）

实验步骤

一、斑马鱼饲养及胚胎采集

成鱼饲养条件：28 °C 恒温饲养；光暗时间 14 h:10 h ；每日给予两次饲喂。具体养殖条件参照 (Westerfield, 2000)

胚胎采集：选择红细胞荧光标记的转基因鱼系，实验前一日 19:00 之前将雌雄鱼按 1:1 ，2:1 或 2:2 的比例放于交配盒中，用挡板隔开雌雄鱼。第二日 9:00 左右抽出挡板，雌雄鱼进行交配。待其产卵后，将受精卵收集至 10 cm 培养皿中，置于 E3 胚胎培养液中，于生化培养箱中 28.5 °C 孵育至受精后 24 小时。

抑 制黑色素生成：胚胎发育至约受精后 24 小时，换液至含有 200 μM PTU 的 E3 胚胎培养液，以抑 制黑色素的生成便于后续显微成像。继续孵育至血流动态观察时期，或相应药物处理时期。

二、斑马鱼胚胎入板及药物处理

胚胎入板：胚胎发育至受精后 24 小时即建立血流，可根据具体实验需求选择合适时期进行血流动态观察。荧光成像前，在体式显微镜下使用一次性实验室用塑料吸管或 1 ml 移液器，将其按每孔一枚胚胎的比例移入 96 孔板，每孔放置 300 μl E3 培养液或添加药物的培养液，并进行后续实验操作。

早期胚胎破膜：斑马鱼胚胎外层绒毛膜约在受精后 30-48 小时自行破裂，胚胎自然脱壳。但如需观测早期血流，则需要进行人工破膜。将胚胎孵育于添加 2 mg/ml 蛋白酶的 E3 培养液约 10 分钟后，使用 E3 培养液润洗 3-4 次，使胚胎与绒毛膜分离。

药物处理：如需药物处理构建疾病模型或进行药理学分析，待胚胎发育至相应阶段， 进行药物处理。以苯肼造模及阳性抗凝药阿司匹林为例 (Sheng et al., 2020)：

• 阿司匹林预保护：待胚胎发育至受精后 2 天，将胚胎按每孔一条的比例移入 96 孔板，加入 300 μl 含 15 μg/ml 阿司匹林的 E3 培养液，孵育 24 小时。

• 苯肼血栓造模：待胚胎发育至受精后 3 天，加入 300 μl 含 0.75 μM 苯肼的 E3 培养液，造模 12 小时后，替换为 300 μl E3 培养液，进行后续拍照分析。

三、斑马鱼胚胎血流拍摄

胚胎麻醉：在 E3 培养液中添加 0.016% 3- 氨基苯甲酸乙酯后，等待约 10 分钟。体式显微镜下用移液枪头轻触胚胎，如无明显逃避反应，提示麻醉成功，此时胚胎大多呈现侧躺状态。

拍摄血流动态视频：使用高内涵成像系统进行逐孔自动拍摄（图 1-2 ）。首先在 2 倍镜或 4 倍镜下定位胚胎并进行初步手动对焦，也可使用高内涵成像平台自带软件 MetaXpress 编程进行自动对焦。选中血管区域，切换 20 倍镜拍摄视频，拍摄速度为 35.7 帧/秒 （详见视频 1 ）。

四、斑马鱼胚胎红细胞流速定量分析

自动定量红细胞流速：拍摄后，选取每个斑马鱼胚胎相同部位的背主动脉和尾静脉位点进行观察，使用 MetaXpress 软件自动测算该位点在单位时间内流过的红细胞数目（图 3-4 ）：MeasureàRegion  MeasurementsàSelect RegionàMeasure Integrated Intensity  。

血流流速分类：首先计算出对照组血流速度的平均值△，将 ≥70%△ 定义为“血流正常”，反之则定义为“外周血流受阻”。该比值可因具体实验中观测到的阳性药药效或目标筛查敏感度而定 (Sheng et al., 2020) 。

样本重复及统计分析：建议各组设置 8-12 枚胚胎，并计算出一个血流正常比例数值，作为单个生物样本重复。各组都进行至少 3 次生物样本重复。两组间采用Student’s t-test 分析进行比较，多组间采用 one-way anova 分析比较，P<0.05 认为有统计学意义。

结果与分析

在低倍镜下定位胚胎

图 1. 空白对照组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎

图 2. 苯肼血栓造模组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎

对高倍镜下拍摄视频中血流速度的自动分析

图 3. 空白对照组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎血流流速定量分析

图 4. 苯肼血栓造模组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎血流流速定量分析

溶液配方

E3 胚胎培养液

0.29 g/L NaCl, 0.013 g/L KCl, 0.048 g/L CaCl2 •2H2O, 0.082 g/L MgCl2 •6H2O, pH 7.2，使用去离子水配制。

致谢

感谢浙江大学药物信息学研究所 -Molecular Devices 高内涵成像联合实验室的设备支持。该项目受国家自然科学基金（项目编号 81822047 ）的支持资助。

2020年7月3日，二氧化硅材料行业的专家们齐聚美丽的羊城广州，参加由粉体圈主办，丹东百特仪器有限公司参与赞助的“2020全国二氧化硅材料创新与应用技术交流会”。

在此次交流大会上，百特技术总监李雪冰博士分享了以“超细硅微粉/白炭黑粒度检测体系的建立和质控相关方案”为题的报告，李博士用简洁幽默的语言，通过大量的应用案例和实测数据，对于二氧化硅材料领域中颗粒检测的难点与痛点进行梳理，演讲富有激情，内容深入浅出，与会者掌声连连。

与此同时，丹东百特Bettersize2600干湿法激光粒度仪、BT-1600显微图像仪等多台仪器亮相本次二氧化硅材料展，吸引了许多参展者的驻足。会场上的专业观众及参展企业对百特仪器表示出极大的兴趣，纷纷围绕在百特展台前提出各自关注的问题。许多客户还在现场进行了详细咨询，希望通过这次机会与百特进行深入合作。作为的粒度、粒形、粉体特性检测仪器的供应商，丹东百特始终积极参与各类重要的材料行业颗粒检测解决方案的研究与构建，希望与业界密切配合，发挥自己的技术优势，助力ZG粉体产业的腾飞。

本次展会中，在与众多客户达成了合作协议或意向的同时，百特还与同行进行了友好交流，结交到了许多新朋友，了解到了二氧化硅材料行业的Z近行情，开拓了视野，也给百特今后的发展带来新的契机和思路。至当天傍晚，2020年二氧化硅材料行业交流会议在与会者们一片称赞声中正式拉下帷幕，百特公司的技术汇报与仪器展示活动圆满完成，给此次旅程画下一个圆满的句号。百特期待与您下次再会！

医药发展依赖于新药开发的进度，而高通量药物筛选（High-Through Screening，HTS）可短时间内筛出数种化合物，有助于加速研究进程，因此高通量药物筛选技术在世界范围内得以广泛应用。学术研究和生物制药公司加大投资力度将会推进高通量药物筛选技术市场的发展，而高通量药物筛选技术的也是生命科学研究乃至整个医药行业发展的原动力。

随着技术的进步和先进迭代产品不断增加，预计未来高通量药物筛选技术市场内将迅速增长 , 而高通量药物筛选技术的应用也会随之迅速增加。此外，随着高内涵（High-Content Screening，HCS）系统的不断完善，基于细胞的测定有望得到更多的利用，并且从生化测定向基于细胞测定的方式大幅转变。Molecular Devices 公司的 ImageXpress 系列高内涵系统，不但提供了细胞成像技术实现的所有细节和功能，其完善的激光自动聚焦加图像自动聚焦技术有极大的兼容性和开放性，能够实现未来新型耗材和方法的检测和分析。MetaXpress PowerCore 高内涵并行加速软件系统能够大大提高系统分析通量，加速药物检测的速度，节省时间和人力的成本。这些特性决定了 ImageXpress 系统将会成为高内涵筛选中不可替代的筛选检测终端，为医药事业的发展做出巨大的贡献！

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　　直线度测量仪是基于光电测径仪的在线检测设备，因此它即可测量直线度尺寸，也可测量外径尺寸，它采用3台测径仪对在线生产的棒线材进行在线检测，通过计算分析，即可得到直线度尺寸。

　　整个系统中测量仪安装在轧制现场，控制柜安放在控制室或其它环境适合电脑工作的室内。测量仪的供电电源由控制柜引入，测量仪的12组测头采用串口服务器合并成1路数据后通过网线或光缆传输至控制柜内的工控机。

　　测量仪的测量区内设置过钢导槽和托辊，入料口设置喇叭口，便于棒材入料。导槽的后部宽度约为80mm（可协商确定），保证棒材通过时处于测量区内。

　　测径工作介绍：棒材通过测量仪的测量区，每台小型测量仪分别实时采集直径数据。当外径测量的数据超过设定的公差范围时，声光报警器自动声光报警。测量的数据传输到控制柜中进行存储、显示、分析等。

　　直线度工作介绍：3台小型测量仪同时采集各截面边沿的位置，计算圆棒的直线度误差，与测径数据采集不冲突。当直线度超过设定的公差范围时，声光报警器自动声光报警，达到合格判定的目的。测量的数据传输到控制柜中进行存储、显示、分析等。

　　直线度测量仪设有专业的软件系统，可对标称值、正负公差、产品型号等进行设置，同时显示6组通道的测量值，平均直线度等尺寸,还可进行图像分析。

　　直线度测量仪还是自动化的在线检测设备，能安装于生产线上进行测量，它可实现长距离大范围的连续测量，同时具有精度高，测量准确性好的特点，这种自动化的在线直线度测量仪在现代工业及国民经济建设中有广泛的应用前景。

      斑马鱼是一种广泛使用于科研与药物研发的模型系统，由于其与人类疾病表型的相似性而广受欢迎。许多基于成像的实验可用来测定斑马鱼的表型变化，但是图像的手动采集和分析非常繁琐且耗时。这些过程的自动化会大大提高通量及数据质量。在这里，我们展示了Operetta CLS™和Opera Phenix™如何进行高通量的斑马鱼的成像和表型分析、筛选，使您能够专注于数据评估而不是数据生成。

自动检测高分辨率图像-轻松锁定斑马鱼

      用普通显微镜对96孔板中的斑马鱼进行定位与成像非常耗时的。Harmony® 高含量分析软件融合了PreciScan™智能图像采集工具，集成低倍率预扫描工作流程，图像分析，更高的放大倍率重新扫描，可完全实现自动化，以减少采集时间和无效的数据量，并显著加快分析速度。斑马鱼的明场成像，通过PhenoLOGIC™ 人工智能使图像分割变得容易（图1和图2）。

通过机器自学习在微孔板中自动检测斑马鱼

通过智能图像识别提高检测通量

通过自动水浸镜头获取高分辨率共聚焦图像

使用Harmony® 成像和分析软件简化与流程化图像分析

图1：自动定位：使用Harmony中的PhenoLOGIC功能对斑马鱼自动定位。A-5X明场预扫描。B-PhenoLOGIC经过鼠标点击培训区分鱼（绿点）和背景（红点）C-以PhenoLOGIC为基础的鱼类识别，使用形状进一步优化，过滤去除较小的错误识别的地区。

图2：PreciScan预扫描定位下一步高倍镜扫描的区域

以20x（1.0 NA水浸镜头）扫描预扫描的定位区域。Z轴共聚焦50层的Z大投影。700张图像的采集时间<2分钟。自动检测和采集意味着无人值守。

表型的自动量化

分析基因表达模式

图3：表达CFP，GFP，YFP和mCherry标记蛋白的斑马鱼。样品由维也纳CCRI提供。

自动准确地确定形态特征

Harmony® 成像与分析软件可以轻松检测荧光强度，形态和纹理的变化。示例（图4）显示单个荧光染料可用于识别不同的身体部分。根据宽度识别头部与脊柱。等效椭圆用于描述脊柱的形状并估计其曲率。尾轴（图5）以类似的方式，自动检测尾部曲率。

图4：单一荧光染料，计算确定斑马鱼头部/尾部比例

图5：尾轴的自动检测。

在3D图像中，依旧看到细节

Harmony软件提供了3D图像的可视化样品的工具， Opera Phenix和Operetta CLS高内涵分析系统提供从1.25x到63x的各种放大倍数，63x并配备自动水浸镜头，提高灵敏度，减少深层样本成像中的光学畸变。

图6：斑马鱼尾部血管3D重构

图7：表达GFP和RFP的个体红细胞

复制右边括号链接进行下载该方案完整版资料：（www.yiqi.com/technology/file_157230.html）

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

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