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摘要：

哺乳动物出生后心脏生长的方式由心肌细胞增殖逐渐转变为心肌细胞肥大，成年心脏受损后心肌细胞增殖不足以弥补丢失的心肌细胞，所以探究心肌细胞增殖机制对于受损心肌补充新的心肌细胞至关重要。磷酸化组蛋白 H3 (pH3) 在细胞有丝分裂过程中高表达，作为一种核分裂标志物，是检测心肌细胞增殖的常用指标。高内涵筛选分析技术是一种能够进行荧光显微成像和定量图像分析的自动化高通量筛选技术，能够将所得实验数据进行量化，更加清楚明了展现实验结果。在这里，我们使用高内涵筛选分析系统分析 pH3+ 阳性心肌细胞数量，以评估心肌细胞增殖的程度。

材料与试剂

1. 1 天、30 天龄 C57BL/6J 小鼠（维通利华）

2. 湿盒

3. 组化笔（abcam, catalog number: ab2601）

4. 盖玻片（世泰，catalog number: 10212450C）

5. 粘附载玻片（世泰，catalog number: 188105）

6. 组织包埋盒（世泰，catalog number: 31050102w）

7. PBS 缓冲液粉末 pH7.3（中杉金桥，catalog number: ZLI-9062）

8. PBS 缓冲液 pH7.4（gibco, catalog number: C10010500BT）

9. 4% 多聚甲醛（LEAGENE, catalog number: DF0135）

10. 50X EDTA 抗原修复液（LEAGENE, catalog number: YB-23522-1）

11. DEPC 水（LEAGENE, catalog number: NR0001）

12. Tween 20（Biofroxx, catalog number: 1247ML500）

13. 山羊血清封闭液（中杉金桥，catalog number: ZLI-9056）

14. Trito x-100 破膜液（Sigma-Aldrich, catalog number: X100）

15. 抗体稀释液（中杉金桥，catalog number: ZLI-9030）

16. pH3 抗体（Millipore，种属反应性：小鼠，人，catalog number: 06-570）

17. α-actinin 抗体（Abcam，种属反应性：小鼠，大鼠，人， catalog number: ab9465）

18. Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光抗体（Invitrogen, catalog number: A21206）

19.  Alexa Fluor 594 羊抗鼠免疫荧光抗体（Invitrogen, catalog number: A21203）

仪器设备

1. 全自动组织脱水机（Leica, catalog number: ASP300S）

2. 包埋机（Leica, catalog number: EG1150H）

3. 石蜡切片机（Leica, catalog number: RM2235）

4. 展片机（Leica, catalog number: HI1210）

5. 烤片机（Leica, catalog number: HI1220）

6. 全自动染色机、封片机（Thermo Fisher Scientific, catalog number: ClearVue+ Gemini）

7. 超纯水设备（Thermo Fisher Scientific, catalog number: 50136146）

8. 电磁搅拌器（IKA, catalog number: MS100）

9. 脱色摇床（海门麒麟医用仪器厂，catalog number: TS-2）

10. 涡旋振荡器（Scientific Industries, catalog number: SI-0256）

11. 台式高速冷冻离心机（Eppendorf, catalog number: 5804R）

12. 移液器（Eppendorf）

13. 普通 4 °C 冰箱

14. 共聚焦显微镜（Zeiss, catalog number: LSM 800）

15. 高内涵筛选分析系统（Molecular Devices, catalog number: ImageXpress Micro）

软件

1. ZEN

2. MetaXpress

实验步骤

一、石蜡切片的制备

1、1 天、30 天龄的 C57BL/6J 小鼠购买自北京维通利华公司；

2、1 天龄小鼠置于冰上麻醉 2 min，30 天龄小鼠按照 0.2ml/20g 注射浓度为 17.5 μg/ml 的三溴乙醇溶液进行麻醉。剪刀剪开小鼠胸腔部分皮肤和皮下组织肌肉层，镊子撑开胸腔，迅速剪下心脏和流出道置于预冷的 PBS 缓冲液中，剪掉血管连带的多余组织，排出心脏中的血液；

3、4% 多聚甲醛中固定心脏组织。1 天龄小鼠心脏组织固定 24 h，30 天龄小鼠心脏组织固定 48 h。固定结束后将心脏组织置于包埋盒中在流动水下冲水，去除心脏组织中的多聚甲醛液体；

4、依据心脏组织大小使用全自动脱水机的不同程序进行脱水，样本依次置于 75%、85%、95% 和无水乙醇中，随后在二甲苯中透明，最 后置于 60 °C 液态石蜡浸泡；

5、使用石蜡包埋机将心脏组织按照胸腔中心脏位置摆放，利用石蜡将心脏组织固定于包埋盒中；

6、蜡块置于冰冻机冷冻 1 小时，展片机预热温度至 45 °C，使用 Leica 石蜡切片机切至心脏最 大面，使得心脏腔室完全暴露（图 1），随后按照 5 μm 厚度进行切割，使得组织切片完全粘附于载玻片，待用。

二、免疫荧光染色

1、组织粘附的载玻片置于烤片机上 68 °C 烘烤 45 min ，防止 脱片；

2、载玻片依次放入二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 中各 10 min ，乙醇浓度为 100%、95%、80%、75%、50% 中水化 5 min ，蒸馏水洗 5 min ；

3、提前配制 1× EDTA 抗原修复液（pH=9.0）于高压锅内煮沸，将心脏组织切片放入高压锅中，使得修复液完全覆盖组织切片，高温修复 2 min ，流动水下冲洗冷却 20 min ；

4、PBST 缓冲液冲洗 5 min ，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5 min ，3 次；

5、配制 0.3% 封闭通透液滴加在心脏组织切片上，室温孵育 1 h ；

6、抗体稀释液稀释 pH3 一抗与 α-actinin 一抗滴加到切片组织表面，4 °C 过夜；

7、一抗孵育 16 h 后，室温复温 1 h ；

8、PBST 缓冲液冲洗 5 min ，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5 min ，3 次；

9、按照 1:400 比例使用 PBS 稀释 Alexa Fluor 594 羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光二抗，适量滴加于心脏组织切片上，室温避光孵育 1h；

10、PBST 缓冲液冲洗 5min ，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5min ，3 次；

11、含 DAPI 的封片剂进行封片，注意封片时不能有气泡产生。

三、荧光共聚焦显微镜成像

使用荧光共聚焦显微镜进行成像（图 2）。

四、高内涵筛选分析系统图像采集

采用 High Content Image Processing Software 进行图像采集（图 3），流程如下：

1、使用无水乙醇将玻片擦拭干净，晾干后置于高内涵筛选分析系统中进行图像采集与分析；

2、打开 MetaXpress 5.1 软件，选择 10 倍物镜，根据采集对象选择单个玻片采集；

3、每个心脏组织框选 18 × 18 个视野，我们选择 DAPI、FITC、Texas Red 三个荧光通道，选取一个视野调整荧光通道参数；

4、动态拍照状态下选择采集区域；

5、采集图像。

五、高内涵筛选分析系统数据分析

选择采集的图像荧光信号（图 3），选择一个视野分别对三个荧光通道进行参数调整， 首先调整“All nuclei”荧光强度圈选出 DAPI 标记的细胞核，其次根据“GFP”荧光强度圈出 pH3+ 表达位点，最 后根据“Texas Red”圈出 α-actinin 标记的心肌细胞（图 4）， 统计细胞核中表达 pH3 的心肌细胞数量即为增殖的心肌细胞数量（图 5）。

结果与分析

1、HE 染色展示石蜡切片机切至心脏最 大面，心脏四腔室完全暴露（图 1）。

图 1.HE 染色展示心脏石蜡切片最 大面

2、使用共聚焦荧光显微镜对心脏组织切片进行成像，Z 轴扫描显示 pH3 与心肌细胞细胞核共定位（图 2）。

图 2.荧光共聚焦显微镜成像

哺乳动物出生后 1 周心肌细胞退出细胞周期（Alkass et al.,2015），因此，在小鼠出生后 1 天心肌细胞增殖旺盛，pH3+ 细胞数量较多；而小鼠出生 30 天心肌细胞几乎不再增殖，pH3+ 心肌细胞无法被检测到。

3、高内涵筛选分析系统分别采集心脏组织切片中 DAPI、FITC、Texas Red 荧光标记的图像流程及采集的荧光信号。按照图 3A 所示流程依次设置图像采集区域，分别将 DAPI 标记的细胞核、pH3 标记的增殖点、α-actinin 标记的心肌细胞荧光信号调至清晰焦面。

图 3. 高内涵筛选分析系统图像采集流程及采集荧光图像。A.图像采集流程界面；B.DAPI 标记的细胞核；C.pH3 标记的增殖细胞；D. α-actinin 标记的心肌细胞；E. 三通道叠加。

4、分析采集图像的荧光信号。

在图 4 中，选择一个图像视野，分别圈出 DAPI 标记细胞核、pH3 标记细胞增殖点、α-actinin 标记心肌细胞的荧光信号。如上图所示，A（左）为分析 DAPI 标记荧光信号的参数设置，A（中）为 DAPI 标记荧光信号的采集图像，A（右）为分析 DAPI 标记荧光信号的圈选区域；B（左）为分析 pH3 标记荧光信号的参数设置，B（中）为 pH3 标记荧光信号的采集图像，B（右）为分析 pH3 标记荧光信号的圈选区域；C（左）为分析 α-actinin 标记荧光信号的参数设置，C（中）为 α-actinin 标记荧光信号的采集图像，C（右）为分析 α-actinin 标记荧光信号的圈选区域。

图 4. 荧光信号图像数据分析设置。DAPI 荧光信号数据分析；B. pH3 荧光信号数据分析；C. α-actinin 荧光信号数据分析。

5、所采集图像的荧光信号分析结束后，系统自动计算 pH3+ 心肌细胞数量所占比例， 格式如下：

采集图像的荧光信号分析结束后，根据 DAPI、FITC、Texas  Red 三通道定位情况，计算细胞核中表达 pH3 的心肌细胞数量，得出如图 5 所示的结果。“Subtotal Profile 1XX”表示 DAPI 染细胞核的数量为 1156 ，“Subtotal Profile 12X”表示 DAPI 与 pH3 共定位的细胞数为 18 ，“Subtotal Profile 1X3”表示细胞核完整的心肌细胞数量为 103 ，“Subtotal Profile 123”表示细胞核表达 pH3 的心肌细胞数为 9 ，则增殖的心肌细胞比例为表达 pH3 的心肌细胞数量与所有的心肌细胞数量之比。

图 5. 高内涵筛选分析系统分析数据结果格式

溶液配方

1、1× EDTA 抗原修复液

将 50× 的 EDTA 抗原修复液 20 ml 加入到 980 ml 超纯水中配制为 1× EDTA 抗原修复液待用；

2、0.3% 封闭通透液

将 3 μl Trito x-100 破膜液加入到 1 ml 山羊血清封闭液中配制为 0.3% 封闭通透液；

3、PBST 缓冲液

将 23 g PBS 粉末加入到 2 L 超纯水中，搅拌至粉末全部溶解，液体澄清，为 PBS 缓冲液；将 2 ml Tween-20 加入到 PBS 缓冲液中，搅拌至澄清，为 PBST 缓冲液。

致谢

感谢中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重 点实验室高精光学技术平台老师的大力支持。感谢国家自然科学基金面上项目（NO. 81770308）基金资助。该实验方案已在 Li et al. (2020)、Wang et al. (2020) 等人发表文章中使用。

      斑马鱼是一种广泛使用于科研与药物研发的模型系统，由于其与人类疾病表型的相似性而广受欢迎。许多基于成像的实验可用来测定斑马鱼的表型变化，但是图像的手动采集和分析非常繁琐且耗时。这些过程的自动化会大大提高通量及数据质量。在这里，我们展示了Operetta CLS™和Opera Phenix™如何进行高通量的斑马鱼的成像和表型分析、筛选，使您能够专注于数据评估而不是数据生成。

自动检测高分辨率图像-轻松锁定斑马鱼

      用普通显微镜对96孔板中的斑马鱼进行定位与成像非常耗时的。Harmony® 高含量分析软件融合了PreciScan™智能图像采集工具，集成低倍率预扫描工作流程，图像分析，更高的放大倍率重新扫描，可完全实现自动化，以减少采集时间和无效的数据量，并显著加快分析速度。斑马鱼的明场成像，通过PhenoLOGIC™ 人工智能使图像分割变得容易（图1和图2）。

通过机器自学习在微孔板中自动检测斑马鱼

通过智能图像识别提高检测通量

通过自动水浸镜头获取高分辨率共聚焦图像

使用Harmony® 成像和分析软件简化与流程化图像分析

图1：自动定位：使用Harmony中的PhenoLOGIC功能对斑马鱼自动定位。A-5X明场预扫描。B-PhenoLOGIC经过鼠标点击培训区分鱼（绿点）和背景（红点）C-以PhenoLOGIC为基础的鱼类识别，使用形状进一步优化，过滤去除较小的错误识别的地区。

图2：PreciScan预扫描定位下一步高倍镜扫描的区域

以20x（1.0 NA水浸镜头）扫描预扫描的定位区域。Z轴共聚焦50层的Z大投影。700张图像的采集时间<2分钟。自动检测和采集意味着无人值守。

表型的自动量化

分析基因表达模式

图3：表达CFP，GFP，YFP和mCherry标记蛋白的斑马鱼。样品由维也纳CCRI提供。

自动准确地确定形态特征

Harmony® 成像与分析软件可以轻松检测荧光强度，形态和纹理的变化。示例（图4）显示单个荧光染料可用于识别不同的身体部分。根据宽度识别头部与脊柱。等效椭圆用于描述脊柱的形状并估计其曲率。尾轴（图5）以类似的方式，自动检测尾部曲率。

图4：单一荧光染料，计算确定斑马鱼头部/尾部比例

图5：尾轴的自动检测。

在3D图像中，依旧看到细节

Harmony软件提供了3D图像的可视化样品的工具， Opera Phenix和Operetta CLS高内涵分析系统提供从1.25x到63x的各种放大倍数，63x并配备自动水浸镜头，提高灵敏度，减少深层样本成像中的光学畸变。

图6：斑马鱼尾部血管3D重构

图7：表达GFP和RFP的个体红细胞

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关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

      Extracellular signal-regulated kinase（ERK）是胚胎发生，细胞分化，细胞增殖和细胞死亡调控的关键组成部分。ERK途径起源于质膜中的活化受体，并通过Ras/Raf/MEK至ERK（图1）。

      图1. Ras/Raf/MEK/ERK信号级联将信号从细胞表面受体如EGF受体（EGFR）传播到细胞内蛋白质。ERK是该途径的Z终组分，并且在被生长因子（例如EGF（表皮生长因子））激活后，触发下游效应，如激酶或转录因子的激活。

      该途径被不同类型的受体激活，包括受体酪氨酸激酶 （例如EGF受体）以及G蛋白偶联受体。作为信号传导途径的Z终组分，ERK磷酸化不同的细胞内蛋白质，包括大量其他激酶和转录因子。ERK信号传导途径存在于各种癌症类型中，因此正在研究作为ZL干预的靶标。

      在这里，我们描述了如何在Operetta CLS高内涵分析系统上自动化研究ERK信号传导的活细胞FRET测定。该测定可以用于药物发现。

基于FRET的ERK生物传感器

      FRET是从供体分子到受体分子的非辐射能量转移。能量转移需要供体和受体间隔小于10nm，因此提供了研究分子接近度变化的敏感工具，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用（分子间FRET）或蛋白质的构象变化（分子内FRET）。在这项研究中，我们专注于分子内FRET，使用称为EKAREV的CFP-YFP生物传感器（图2）。稳定表达EKAREV的细胞由Somponnat Sampattavanich博士友情提供（图3）。在该生物传感器中，供体和受体荧光团以单一融合蛋白编码。EKAREV生物传感器经过优化，可以减少随机触发的基础FRET信号，并使其可靠地与距离相关。ERK对EKAREV的磷酸化触发构象变化，使CFP和YFP靠近诱导FRET。

图2.细胞外信号调节激酶活性报告基因（EKAREV）的示意图。在该生物传感器中，两种荧光蛋白通过ERK底物结构域，接头和结合结构域分开。一旦ERK底物结构域经过ERK的磷酸化，就会触发构象变化，使CFP和YFP紧密接近并允许FRET发生。

      EKAREV生物传感器是分子内FRET的实例，其中供体和受体以1：1的固定化学计量存在。因此，进行双通道比率实验就足够了，通道1检测受体发射光(

IAcceptor)，通道2检测供体发射光(IDonor)，将得到的两个荧光信号强度进行背景校正，并计算它们的比率以给出相对FRET效率EFRET:

测定方法

      将1.2×104EKAREV细胞/孔接种到CellCarrier-96Ultra微量培养板（PerkinElmer＃6055300），150μl培养基（表1）中。孵育2天后（37℃，5％CO2），150μl饥饿培养基洗涤两次并在饥饿培养基中孵育5小时以降低基础ERK活性。另外，在孵育开始时向细胞中加入各种浓度的YZ剂或DMSO。4.5小时后，将细胞核用4μM DRAQ5在37℃，5％CO2下染色30分钟。然后用饥饿培养基洗涤细胞一次，并加入含有8μl 20x浓缩YZ剂或DMSO对照的150μl新鲜饥饿培养基。作为对照，在某一时间点，向细胞中加入8μl20x浓缩诱导物（PMA或EGF）。为了YZFRET信号，应用PD184352，SCH772984和Ulixertinib。含有或不含有所测试化合物的Z高DMSO浓度的培养基用作对照。

试剂，化合物和介质列表

成像

      在宽场模式下使用20x高NA物镜（NA 0.8）在Operetta CLS系统上建立长时间实验，获取图像总共97分钟。将FRET诱导化合物添加到血清饥饿细胞后，开始时间序列，测量间隔为每8分钟一次，在此设置中获得了四个渠道：DRAQ5 （ex 615-645，em655-760），CFP（ex 435-460，em 470-515），YFP（ex490-515，em 525-580）和FRET（ex 435-460，em 515-580）（图3）。

图3.稳定表达EKAREV生物传感器的人乳腺上皮细胞。细胞核用DRAQ5染色。随后，在Operetta CLS系统上使用宽场模式的20x高NA物镜对细胞成像。

分析策略

      使用Harmony®高内涵成像和分析软件进行自动图像分析。简言之，将图像分割成细胞和背景。计算细胞质和背景中的供体和FRET强度，然后计算背景校正的FRET比率作为Z终结果（图4）。

图4.使用Harmony软件进行比率FRET定量的图像分析工作流程：细胞和背景的细胞质被分段，低表达细胞被强度阈值排除。量化供体和FRET通道的强度及其适当的背景，并计算背景校正的FRET强度比。减去背景强度在活细胞应用中尤其有利，其中具有自发荧光组分的培养基通常导致更高的背景并因此导致更小的测定窗口。

结果

为了探索是否可以使用基于FRET的生物传感器在Operetta CLS上研究ERK信号传导的调节，用不同的ERK和MEK激活剂和YZ剂处理EKAREV细胞。（图5）。

图5.外源添加的活化剂（绿色）和YZ剂（红色）示意图及其对ERK信号通路的影响。表达EKAREV的细胞用EGF或PMA处理以诱导ERK活化，另外，用三种MEK和ERK特异性YZ剂（PD184352，SCH772984，Ulixertinib），在途径的不同位置中断信号转导。

      PMA和EGF充当Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的特异性激活剂。EGF特异性结合细胞表面上的EGF受体，而PMA作为亲脂性，膜可渗透的分子通过直接激活RAF激活该途径。PD184352可以通过选择性YZMEK1/2来YZERK途径，而Ulixertinib和SCH772984都是ERK1/2的有效和选择性YZ剂。

      首先，为了更多地了解FRET诱导和YZ的动态性质，记录了97分钟的长时实验。正如所料，与未处理的对照相比，单独用EGF或PMA处理细胞导致FRET比率的强烈增加（图6）。大约30分钟后信号处于高位。对照显示较低水平的ERK活化，并且观察到随时间稳定增加。由于ERK1/2可以通过多种生长因子和有丝分裂来调节，这可能是由活细胞成像过程中的自分泌或旁分泌信号引起的。用不同浓度的ERKYZ剂（SCH772984）共同处理细胞导致ERK反应的剂量依赖性降低。在5μMSCH772984中，通过EGF的ERK活化几乎可以忽略不计，表明在该浓度下ERK被完全YZ。请注意，0.5％DMSO是实验中使用的Z高浓度，确实对FRET比率有影响，因此需要包括此对照。用第二种ERK1/2特异性YZ剂Ulixertinib获得了类似的结果（数据未显示）。

图6.在Operetta CLS系统上使用基于EKAREV FRET的生物传感器的ERK信号传导的时间进程。通过EGF或PMA刺激ERK诱导快速FRET信号增加，在约30分钟后平稳。高浓度的SCH772984（5μM）导致几乎完全YZERK活化（1μg/ ml EGF），没有可测量的FRET信号增加。较高稀释度的SCH772984仅部分YZEGF诱导的ERK活化。control显示没有任何处理的样品有中间轻微上升的FRET信号。0.5％DMSO略微YZFRET信号，这是实验中使用的DMSO的Z高浓度。测定统计：Z'= 0.87（在时间点32分钟计算，DMSO为阴性，EGF为阳性对照）

      当FRET信号在32分钟后达到恒定水平时，选择该时间点以确定SCH772984的IC50值。用1μg/ mL EGF和系列稀释的SCH772984处理EKAREV细胞，稀释范围为10pM至3μM。计算的IC50值为272nM的剂量反应曲线如图7所示。

图7.ERKYZ剂SCH772984导致基于FRET的EKAREV信号的剂量依赖性降低。在1μg/ ml EGF存在下，用递增浓度的SCH772984处理EKAREV细胞。在孵育32分钟后，在Operetta CLS系统上测定FRET比率，因为信号在此时间点稳定。高Z'值（Z'= 0.89）显示出优异的分析性能。

      为了研究EKAREV FRET成像测定是否可用于研究直接作用于MEK1/2的途径调节，测试了MEK1/2YZ剂PD184352对PMA化细胞的作用（图8）。如图所示，PD184352YZPMA诱导的ERK活化。

图8.在Operetta CLS系统上测量的PD184352对PMA活化的Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的YZ。EKAREV细胞用另一组活化剂和YZ剂（PMA+PD184352）处理，其作用在RAF/MEK的上游（与图5比较）。用200或2000nM PMA处理的EKAREV细胞显示出高FRET反应（诱导后32分钟）。通过将细胞与MEK1/2特异性YZ剂PD184352以10μM的浓度共孵育来YZ活化。

结论

      EKAREV FRET生物传感器可用于Operetta CLS系统的活细胞成像测定，以研究ERK的激活和YZ。级联内不同靶标的调节很容易测量，因此这种方法可以有助于鉴定干扰Ras/Raf/MEK/ERK信号级联的新化合物。该测定在活细胞中进行，因此它可用于分析ERK信号传导动力学，而定量ERK磷酸化的常规生物化学技术通常是终点测定。尽管细胞群中生物传感器表达水平相对不均匀（图3），但FRET比率的计算提供了特别好的化验数据和统计数据，Z'值高于0.87。

      EKAREV生物传感器的优化设计，Operetta CLS系统的高质量成像以及Harmony内图像分析的出色工具都有助于提高这里提供的高含量FRET分析的稳定性。Harmony软件的构建模块概念允许创建易于设置和理解的图像分析序列，并且不需要专业的图像分析知识。该测定还提供了Opera Phenix™高含量筛选系统的可比较结果和测定统计数据。由于Operetta CLS和Opera Phenix系统比传统显微镜具有更高的通量，基于FRET的生物传感器的高含量成像为药物发现和细胞信号传导中的基础研究开辟了新的可能性。

参考文献

1. Pearson, G., Robinson, F., Beers Gibson, T., Xu, B-E.,Karandikar, M., Berman, K. & Cobb, M. H. (2001).

Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase Pathways: Regulation and Physiological Functions. Endocrine Reviews, 22(2), 153-183. doi/10.1210/edrv.22.2.0428

2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M.,Roberts, K. & Walter, P. (2007) Molecular Biology of the Cell,Garland Science., 5th revised edition, ISBN-10: 0815341059

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7. Komatsu, N., Aoki, K., Yamada, M., Yukinaga, H., Fujita,Y., Kamioka, Y., & Matsuda, M. (2011). Development of an optimized backbone of FRET biosensors for kinases and GTPases.Mol Biol Cell, 22, 4647-56. doi/10.1091/mbc.E11-01-0072

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尊敬的老师：

您好！我们诚挚地邀请您参加5月26日在上海举办的高内涵成像技术与应用研讨会。本次应用研讨会旨在与科学家面对面的交流，分享使用高内涵成像和分析技术的经验，期望为相关研究领域提供有用的信息，拓展思路。

高内涵成像分析系统是一种集高分辨率、自动化、智能化、高通量于一体的通用检测技术平台，其为细胞水平的研究分析提供了高效的解决方案，是创新药物研究、中药药效、肿瘤研究、神经生物学、免疫学、干细胞研究等领域的重要研究工具。此次会议我们邀请企业、科研等专家学者共聚一堂，带来ImageXpress高内涵成像分析系统在各研究领域zui 新进展和应用。

我们期待您的参与，并再次感谢您的关注和支持！

美谷分子仪器（上海）有限公司

时间：2023年5月26日
地点：上海浦东由由喜来登大酒店（上海市浦东新区浦建路38号）
推荐到达方式：地铁4号线塘桥站3号口右转20米

会议日程：

摘要：

心脑血管疾病是近 30 年来全 球较高死亡因素，而血栓形成是心脑血管意外的关键病理过程。在血栓性疾病的病理机制研究和新药研发中，对实验模型的血流动态分析极为必要。新兴脊椎动物模型斑马鱼体外发育且早期胚胎透明，并在受精后 24 小时即建立全身血液循环，故成为研究心血管循环相关疾病的理想动物模型。目前，已有较多标记特定细胞类型的转基因荧光鱼被各实验室广泛使用，例如标记红细胞的 Tg (LCR:eGFP) 鱼系，Tg (gata1:eGFP) 鱼系等，使血流动态观测更为便捷。本文集中介绍了如何使用高内涵成像系统对斑马鱼活体胚胎进行血流动态分析，并以苯肼血栓疾病造模为例，为该方法在观测血栓性疾病的应用进行了展示。本方法具有操作简便、通量大、及活体动态观测等优势，可应用于抗血栓药物及相关药物的大规模高通量体内筛选。

研究背景

血栓事件发生率在全 球逐年增加。其中，动脉血栓形成是缺血性心脏病与中风的关键病理机制，而静脉血栓形成可导致静脉栓塞与肺栓塞，是癌症病患中的主要致死因素。抗血栓治 疗主要包括抗凝与抗血小板治 疗。前者代表性药物如肝素、华法林等，主要通过抑 制凝血级联反应中的凝血因子发挥作用；后者则主要作用于血小板活化信号通路中的关键靶点，如环氧化酶抑 制剂阿司匹林通过抑 制血栓素 A2 合成发挥抗栓作用，是心脑血管血栓性事件二级预防的一线用药 (Depta  and  Bhatt,  2015) 。然而，包括阿司匹林在内的抗栓药物仍存在较多临床局限性，如导致消化道出血等，临床使用仍存在争议 (Raber et al., 2019) 。因此，抗栓治 疗领域的新药研发仍是重要研究方向。在血栓性疾病的病理机制研究和新药研发中，对实验模型的血流动态分析极为必要。斑马鱼是新兴脊椎动物模式生物，因其繁殖力强，胚胎体型小且早期透明等独特优势，倍受发育生物学及大规模毒理学及药理学筛选相关研究的青睐。其中，斑马鱼胚胎在受精后 24 小时即建立全身血液循环，且其心血管系统相关信号通路与人类高度保守，故成为研究心血管循环相关疾病的理想动物模型。本课题组前期工作结合红细胞特异性荧光标记转基因荧光鱼，例如 Tg (LCR:eGFP) 鱼系 (Ganis et al., 2012) ，Tg (gata1:eGFP) 鱼系 (T raver et al., 2003) 等，使用苯肼构建血管内皮及红细胞膜损伤相关的血栓疾病模型，对活 血化瘀类中成药中的抗栓活性成分进行了筛选及深入分析 (Sheng et al., 2020；Li et al., 2021) 。实验工作中发现，使用手动式显微镜逐孔视频拍摄，及后期基于视频与其他图像处理软件的红细胞流速定量分析过程对时间与人力成本要求较高，难以适应大规模药理筛选的通量要求。而使用高内涵成像系统，可自动进行拍摄，并通过其配套软件完成血流定量分析，具有操作简便、通量大、及活体动态观测等优势，可应用于抗血栓药物及相关药物的大规模高通量体内筛选。因此本文以苯肼血栓疾病造模为例，介绍高内涵成像在斑马鱼活体胚胎进行血流动态分析相关实验方法，对该方法在观测血栓性疾病的应用进行了展示。

材料与试剂

1. Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼 (Ganis et al., 2012) （购自浙江大学公共技术平台斑马鱼分平台）

2. 苯肼（阿拉丁, catalog number: G1324044）

3. 阿司匹林（碧云天, catalog number: M0119A）

4. 1-苯基-2-硫脲 (PTU) (Sigma-Aldrich, catalog number: 103-85-5)

5. 亚甲基蓝（阿拉丁, catalog number: M19650）

6. 3-氨基苯甲酸乙酯（Sigma-Aldrich, catalog number: MS-222）

7. 二甲基亚砜（阿拉丁, catalog number: D103281）

8. 蛋白酶（Roche, catalog number: 165921）

9.  一次性实验室用塑料吸管（为尔康, catalog number: W208）

10. 96 孔黑板（Corning, catalog number: 3340）

11. E3 胚胎培养液（见溶液配方）

仪器设备

1. 高内涵成像系统（Molecular Devices, model: ImageXpress Micro Confocal）

2. 体式显微镜（麦克奥迪, model: SMZ-168）

3. 微量移液器（德国, model: Eppendorf）

4. 实验用斑马鱼养殖与繁育系统（上海海圣, model: Z-C-D5）

5. 智能生化培养箱（宁波赛福, model: SPX-250）

实验步骤

一、斑马鱼饲养及胚胎采集

成鱼饲养条件：28 °C 恒温饲养；光暗时间 14 h:10 h ；每日给予两次饲喂。具体养殖条件参照 (Westerfield, 2000)

胚胎采集：选择红细胞荧光标记的转基因鱼系，实验前一日 19:00 之前将雌雄鱼按 1:1 ，2:1 或 2:2 的比例放于交配盒中，用挡板隔开雌雄鱼。第二日 9:00 左右抽出挡板，雌雄鱼进行交配。待其产卵后，将受精卵收集至 10 cm 培养皿中，置于 E3 胚胎培养液中，于生化培养箱中 28.5 °C 孵育至受精后 24 小时。

抑 制黑色素生成：胚胎发育至约受精后 24 小时，换液至含有 200 μM PTU 的 E3 胚胎培养液，以抑 制黑色素的生成便于后续显微成像。继续孵育至血流动态观察时期，或相应药物处理时期。

二、斑马鱼胚胎入板及药物处理

胚胎入板：胚胎发育至受精后 24 小时即建立血流，可根据具体实验需求选择合适时期进行血流动态观察。荧光成像前，在体式显微镜下使用一次性实验室用塑料吸管或 1 ml 移液器，将其按每孔一枚胚胎的比例移入 96 孔板，每孔放置 300 μl E3 培养液或添加药物的培养液，并进行后续实验操作。

早期胚胎破膜：斑马鱼胚胎外层绒毛膜约在受精后 30-48 小时自行破裂，胚胎自然脱壳。但如需观测早期血流，则需要进行人工破膜。将胚胎孵育于添加 2 mg/ml 蛋白酶的 E3 培养液约 10 分钟后，使用 E3 培养液润洗 3-4 次，使胚胎与绒毛膜分离。

药物处理：如需药物处理构建疾病模型或进行药理学分析，待胚胎发育至相应阶段， 进行药物处理。以苯肼造模及阳性抗凝药阿司匹林为例 (Sheng et al., 2020)：

• 阿司匹林预保护：待胚胎发育至受精后 2 天，将胚胎按每孔一条的比例移入 96 孔板，加入 300 μl 含 15 μg/ml 阿司匹林的 E3 培养液，孵育 24 小时。

• 苯肼血栓造模：待胚胎发育至受精后 3 天，加入 300 μl 含 0.75 μM 苯肼的 E3 培养液，造模 12 小时后，替换为 300 μl E3 培养液，进行后续拍照分析。

三、斑马鱼胚胎血流拍摄

胚胎麻醉：在 E3 培养液中添加 0.016% 3- 氨基苯甲酸乙酯后，等待约 10 分钟。体式显微镜下用移液枪头轻触胚胎，如无明显逃避反应，提示麻醉成功，此时胚胎大多呈现侧躺状态。

拍摄血流动态视频：使用高内涵成像系统进行逐孔自动拍摄（图 1-2 ）。首先在 2 倍镜或 4 倍镜下定位胚胎并进行初步手动对焦，也可使用高内涵成像平台自带软件 MetaXpress 编程进行自动对焦。选中血管区域，切换 20 倍镜拍摄视频，拍摄速度为 35.7 帧/秒 （详见视频 1 ）。

四、斑马鱼胚胎红细胞流速定量分析

自动定量红细胞流速：拍摄后，选取每个斑马鱼胚胎相同部位的背主动脉和尾静脉位点进行观察，使用 MetaXpress 软件自动测算该位点在单位时间内流过的红细胞数目（图 3-4 ）：MeasureàRegion  MeasurementsàSelect RegionàMeasure Integrated Intensity  。

血流流速分类：首先计算出对照组血流速度的平均值△，将 ≥70%△ 定义为“血流正常”，反之则定义为“外周血流受阻”。该比值可因具体实验中观测到的阳性药药效或目标筛查敏感度而定 (Sheng et al., 2020) 。

样本重复及统计分析：建议各组设置 8-12 枚胚胎，并计算出一个血流正常比例数值，作为单个生物样本重复。各组都进行至少 3 次生物样本重复。两组间采用Student’s t-test 分析进行比较，多组间采用 one-way anova 分析比较，P<0.05 认为有统计学意义。

结果与分析

在低倍镜下定位胚胎

图 1. 空白对照组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎

图 2. 苯肼血栓造模组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎

对高倍镜下拍摄视频中血流速度的自动分析

图 3. 空白对照组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎血流流速定量分析

图 4. 苯肼血栓造模组 Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼胚胎血流流速定量分析

溶液配方

E3 胚胎培养液

0.29 g/L NaCl, 0.013 g/L KCl, 0.048 g/L CaCl2 •2H2O, 0.082 g/L MgCl2 •6H2O, pH 7.2，使用去离子水配制。

致谢

感谢浙江大学药物信息学研究所 -Molecular Devices 高内涵成像联合实验室的设备支持。该项目受国家自然科学基金（项目编号 81822047 ）的支持资助。

引言

新陈代谢是生物体内进行的化学变化的总称，是生物最基本的生命活动过程。细胞从环境汲取能量、物质，在内部进行各种化学变化，维持自身高度复杂的有序结构，保证生命活动的正常进行。作为细胞的“能量工厂”，线粒体在维持能量稳态方面发挥重要作用，可以调控蛋白质、脂质、溶质和代谢物产物的进出，并保护细胞质免受有害线粒体产物的影响。线粒体通过不断的分裂和融合，维持线粒体形态、分布和数量，维持细胞稳态，该过程被称为线粒体动力学。线粒体自噬是机体清除细胞内功能异常的线粒体的过程，是线粒体质量控制的主要机制。线粒体动力学的病理改变可导致生物能量功能受损和线粒体介导的细胞死亡，并与多种病理机制相关，包括缺血性心肌病，糖尿病，肺动脉高压，帕金森氏病，亨廷顿氏病，骨骼肌萎缩症、阿尔茨海默病等。

线粒体大小和形状取决于它们在细胞内的位置以及不同细胞对能量的需求。当线粒体发生损伤时，它的形态和完整性会发生改变，如线粒体的数量、大小、长度和形状等。线粒体形态、结构和功能的检测对于了解线粒体的稳态以及功能状态有重要意义。

高内涵成像分析系统非常适合进行线粒体表型和结构的研究。共聚焦成像和水镜可以提高成像质量并更好地显示线粒体结构，高内涵的图像分析工具可以帮助科研工作者获得不同表型的数字特征，线粒体表型和结构重排的分析模块可用于线粒体动力学为基础的细胞研究。

结果展示

使用不同浓度的化合物，包括氯喹（抑 制线粒体循环），鱼藤酮（氧化磷酸化抑 制剂）和缬氨霉素（钾离子载体）处理 PC12（人神经母细胞瘤细胞）。将活细胞用线粒体染料 MitoTracker Orange  和 Hoechst 进行染色，利用 ImageXpress Micro Confocal 系统（Molecular Devices）进行成像，使用共聚焦模式和 40X 水镜拍摄活细胞的图像，分辨单个线粒体并检测线粒体形态变化。使用 MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件中的 Custom Module Editor（自定义模块编辑器）分析图像，使用“Granularity”模块和“Find Fibers”模块识别圆形颗粒和细长的线粒体（图 1）。

图 1 .线粒体形状的表型分析。

Molecular Devices 高内涵成像分析系统适用于各种细胞模型中化合物的药物开发或毒性评估。不同化合物处理会导致线粒体形态变化，膜电位的损失、以及细胞的程序性死亡等。MetaXpress 软件非常适合进行线粒体形态的测定，可以定义每个对象的数量、面积、强度、长度和形状（表1，2）。使用具有共聚焦模式的 40X 水镜对细胞进行成像，MetaXpress 自定义模块编辑器分析图像（图 2）。这些检测结果可以计算剂量反应和各种化合物的有效浓度，以及用数字来表征线粒体结构动力学（图 3）。

图 2 .化合物对线粒体的作用。使用MitoTracker Orange对线粒体进行染色（ 黄色 ），对照组（A）、缬霉素（B）、鱼藤酮（C）。

使用特定浓度的化合物（氯喹，鱼藤酮和缬氨霉素）处理 PC12 细胞，对细胞进行染色和成像。通过图像分析将线粒体结构确定为“纤维”（顶部）或“颗粒”（中部），底部为线粒体染色后荧光强度的变化。EC50的值取决于四个浓度依赖性复本和参数曲线的拟合（图 3）。

图 3 .使用氯喹（绿色），鱼藤酮（红色）和缬氨霉素（蓝色）处理 PC12 细胞。EC50的值取决于四个浓度依赖性复本和参数曲线的拟合。

在分析过程中，我们比较了水镜和空气镜对图像质量和分析的影响。结果显示，使用水镜可以提高图像质量，并且通常会导致 Z' 值增加（ 表 3 ）。图 4 显示了使用自定义模块编辑对线粒体表型进行计数和分析，以评估线粒体的健康、代谢、循环、复合效应和疾病状态等。并且，自定义模块编辑可以针对特定的细胞类型或疾病模型进行进一步的调整和修改。

表 1 .用图 3 所示的曲线定量 EC50。

表 2 .不同的对照和化合物处理方法的比较。上面四列数据分别是对照，10 um 的氯喹，300 nm 的鱼藤酮，和 10 nm 的缬氨酸霉素。

表 3 .与空气镜相比，水镜可以提高图像质量，获得更高的Z’值。

图 4 .自定义模块编辑器（CME）。

总结

Molecular Devices 高内涵成像分析系统适用于各种细胞模型中化合物的药物开发或毒性评估。使用高内涵成像和高级图像分析的线粒体动力学分析方法不仅可以量化线粒体的表型变化，而且这种多参数方法也可用于研究正常和病理结构变化以表征疾病模型或复合效应。

 主要特点 

• 获得高质量的图像，更好地显示线粒体形状和结构的变化

• 以更有效、更精确的方式量化和测量线粒体的表型变化

• 了解疾病的机制并评估各种细胞模型中的化合物毒性

参考文献：

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[2]. Yoon Y, Krueger EW , Oswald BJ , et al. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Molecular & Cellular Biology, 2003, 23(15):5409-5420.

[3]. McLelland GL, Soubannier V, Chen CX, et al. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. Embo Journal. 2014, 33(4):282-295.

[4]. Twig G, Elorza A, Molina AJ, et al. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. Embo Journal. 2008, 27:433–446.

[5]. Longo DL , Archer SL . Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. New England Journal of Medicine, 2013, 369(23):2236-2251.

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2023 年 5 月 26 日由美谷分子仪器（上海）有限公司举办“高内涵成像技术与应用研讨会—上海站”圆满落幕，来自科研院校、医院、生物技术公司等一百多位专家学者参加了本次的研讨会。

会议开始由美谷分子仪器（上海）有限公司全国销售经理谢东先生致开幕词，谢东表示 Molecular Devices 1983 年由斯坦福大学教授创立，隶属于丹纳赫生命科学平台，专注于为科学家服务，40 多年来一直在细分领域精耕细作，同时深耕中国，在中国有研发团队以及生产基地，服务全 球的科学家们。

美谷分子仪器（上海）有限公司全国销售经理谢东

在本次会议上，专家们就热点议题做了专题报告。第 一位报告者是来自上海中医药大学科技实验中心的杨扬研究员。杨老师详细介绍了中医药研究应该关注的研究内容，呈现了中医药研究的整体框架，并从临床药效出发探讨了中药复 方的研究思路和瓶颈。同时，杨老师还分享了如何运用高内涵这种现代技术的手段来突破研究瓶颈，提出了许多有建设性的意见。

上海中医药大学科技研究员杨扬

会上的第二位报告者是同济大学附属东方医院的何志颖研究员，他的报告题目是《干细胞基础与转化研究》。他详细介绍了如何开展多能干细胞诱导分化，包括肝前体细胞、皮肤细胞谱系重编程为肝干细胞及原代肝细胞重编程为肝前体细胞等方案，以实现适宜的非供体来源肝细胞类型获得；并采用局部磁场干预、肝细胞微组织化、生长因子处理等手段，促进移植肝细胞在受体肝脏的植入和增殖，实现肝细胞移植再生肝脏。最后，他们建立了移植细胞在活体内定位和定量的检测方案，实现对移植细胞在受体体内分布的动态观察及在靶器官的植入与增殖分析。这些研究工作为促进肝细胞移植治 疗肝衰竭的临床转化应用提供了理论基础和技术方案。

同济大学附属东方医院研究员何志颖

第三位报告者是上海交通大学的长聘教轨副教授赵砚彬。他带来的主题报告是《斑马鱼神经发育毒性的高通量筛查》。赵教授介绍了如何通过高通量高内涵表型组学筛查斑马鱼胚胎模型，并建立了同步监测斑马鱼胚胎发育过程共计 42 种高通量“表型指纹谱”，来评估不同类型环境化学品低剂量的毒性效应。这项工作有望为环境污染物的风险评估体系提供更为有效和全面的策略。

上海交通大学副教授赵砚彬

最后是来自美谷分子仪器（上海）有限公司产品经理苏园园博士，她介绍了《从 2D 到 3D ，智能化高内涵加速科研与新药研发》。高内涵成像技术结合了自动显微镜和定量图像分析，综合地对细胞的状态、变化、总体趋势进行分析，兼顾了直观与批量统计定量的优点，可快速从 3D 样品中获取信息量丰富、更具生理相关性的数据，在基础科研、药理毒理、药物筛选、精 准医学等方面有着广泛的应用。

美谷分子仪器（上海）有限公司产品经理苏园园博士

除了专家演讲外，现场观众也积极参与互动，与专家一起探讨议题，碰撞出了各种观点，形成了精彩的交流和思想碰撞。

在茶歇期间，许多客户聚集在我们展台前观看高内涵仪器。我们的工程师现场详细演示了如何操作仪器以及如何用AI软件分析图片，让客户深刻了解我们仪器易操作性、软件的便利性，并通过这些演示对我们的产品产生了浓厚兴趣。

三维多细胞类球体（肿瘤球、微球、类器官）可以帮助我们在临床前药物筛选阶段更好地预测多种候选药物的潜在作用。但是，相较于二维单层培养细胞，采用三维培养细胞模型系统进行检测分析则更具挑战性。

一起来看看珀金埃尔默是如何分析3D微组织球三维体积与分区的吧！

3D微组织球的制备和成像过程

使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制备细胞球

在CellCarrier Spheroid表面极低吸附力96孔微孔板（珀金埃尔默公司，货号6055330）中接种 HeLa 细胞，细胞浓度分别为1.25E3、2.5E3与5E3。48小时后，以3.7%甲醇固定，再用DRAQ5™染料对胞核染色。如前文所述，用磷酸化组蛋白H3抗体（西格玛奥德里奇公司，货号H9908）和Alexa 546二抗体（美国生命技术公司，货号A11081）联合标记有丝分裂细胞。为达到快速成像的需求，本实验应用长工作距离物镜，使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。对于高分辨率深度成像试验，本实验将细胞球转入兼容高质量成像CellCarrier 384孔超微孔板（珀金埃尔默公司，货号6057300），然后利用ScaleA2试剂进行透明化处理。

“预扫描（PreciScan）”功能大大缩短图像采集时间并减小数据量

研究人员利用Harmony软件的“预扫描（PreciScan）”功能扫描拍摄所有细胞球的图像。“预扫描（PreciScan）”是一项智能图像采集功能，它可以智能识别确定各孔内目标细胞的x/y坐标位置。通过低倍预扫描、智能联机分析和高倍再扫描，生成目标细胞的高分辨率图像。再扫描可以包含z-stack多层扫描和 / 或时间序列扫描。“预扫描（PreciScan）”功能有效节省了测量和分析时间并减小了数据储存空间（例如，使用20x物镜对在384孔微孔板内培养的细胞球进行观察分析时，预扫描可帮助减少25倍的分析时间和数据储存空间；而使用40x物镜观察时，可减少100倍的分析时间和数据储存空间），Operetta CLS与Opera Phenix系统都配置有这一功能。

利用水浸物镜与光透明化技术优化成像深度

使用水浸物镜，大大提高了成像质量，特别是提升了Z轴分辨率。此外，光透明化处理进一步改善了成像深度。光透明化处理不仅提高了样品内指标的均一性，而且减少了光散射和光学像差。在此基础上，采用长波长染色（如可行）也有利于减少光散射并提高透光率，使更多的激光照射在3D样品上。因此，可显著提升成像深度和信号检测效率。

3D微组织球重构与分析

生成三维或 XYZ 轴图像

生成三维样品的 XYZ 轴或三维图像；

在三维空间中变换样品图像——旋转、缩放或平移；

导出视频——三维重建或涵盖多层平面视图的视频。

定位细胞球与胞核

使用“定位图像区域（Find Image Region）”功能定位整个细胞球；

采用局部光强阈值进行 Z 轴光衰减补偿；

选用一种“定位胞核（Find Nuclei）”方法——专门用于 3D 图像胞核分割。

计算细胞球与胞核三维指标

使用“计算形态特性参数（Calculate Morphology Properties）”工具分析细胞球和球体内单细胞的三维形态特征。

定位有丝分裂细胞

使用“定位胞核（Find Nuclei）”功能，根据局部光强阈值定位有丝分裂、 pHH3 阳性细胞；

使用“裁剪区（Clip Box）”功能生成剖视图，从内部（右侧）观察细胞球。

使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图

进行细胞分区，分析有丝分裂细胞分布情况

计算出每个胞核到细胞球边界的Z短距离；

使用“选择区域”和“选择细胞群”功能，将胞核分成不同区域。可随意调整区域宽度；

分析每个区域有丝分裂细胞数量和空间分布差异，得到各种不同的分析数据（例如，细胞形态参数）。

使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图

基于Harmony4.8软件的整体成像细胞球三维分析方法我们可以检测到细胞球整体的形态学特征和细胞球同心区单细胞特性。采用DRAQ5™染料（红色）和pHH3抗体（橙色）标记细胞球，然后用ScaleA2试剂进行光透明化处理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系统装配的20x水浸物镜（数值孔径1.0）和间距为1µm的 z-stack模块（z轴扫描高度：300µm）记录共聚焦三维图像。Opera Phenix系统的3D成像质量Z佳。经实验发现，Operetta CLS系统在被测HeLa细胞球的成像深度和胞核检测性能方面与之不相上下。此处第4和第5步骤操作仅以Opera Phenix系统成像展示，Operetta CLS系统成像效果与之相当。

参考文献

1. Kriston-Vizi, J., Flotow, H. (2017). Getting the whole picture: high content screening using three-dimensional cellular model systems and whole animal assays. Cytometry, 91: 152–159. doi:10.1002/cyto.a.22907

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7. Boettcher, K., Schreiner, A. (2016). The benefits of automated water immersion lenses for high-content screening. PerkinElmer Technical Note.

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

PhenoTron®-XYZ植物表型成像分析系统，是易科泰生态技术公司基于国际先进光谱成像传感器技术和自主研发的XYZ植物表型自动扫描平台，设计生产的一款适用于实验室或温室高通量植物表型分析系统：

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• FluorCam叶绿素荧光成像技术

• 平台采用STP（Sensor-To-Plant）技术和在线视觉监控

• 可选配基于蒸渗仪技术的iPOT数字化培养盆，全面监测重量变化、土壤水分与温度，及叶片温度、叶绿素荧光、茎流、光合作用等生理生态参数

• 可选配台面式表型分析平台，XYZ安装在样品平台上，特别适合实验室组培苗和种苗表型分析、种质资源检测等

• 应用于种苗与组培苗表型检测、作物表型研究分析、植物生理生态研究、光合生理研究、种质资源检测、胁迫与抗性评估与筛选等 

自左至右依次为：PhenoTron®-XYZ植物表型成像分析系统（可移动）、台面式PhenoTron®-XYZ植物表型成像分析系统、绿豆种苗高光谱成像分析（PRI）

主要技术指标：

1)平台采用STP技术，嵌入式主控系统，全中文操作界面，触控屏+PC端GUI软件双重控制，可无线控制

2)XYZ三轴全自动运行，精 准定位扫描成像分析，运行精度1mm

3)支持组合命令，可自定义Protocols，自动执行XYZ三轴移动、停止、光源开闭、快门触发等

4)支持位置记忆，可一键注册、记录、保存、读取XYZ坐标信息，自动移动精 准定位采集Thermo-RGB及FluorCam叶绿素荧光成像数据

5)机器视觉监控：监控镜头经过算法校准，在线监视全域植物状态和自动扫描成像，通过注册XYZ自动定位采集RGB、红外热成像、FluorCam叶绿素荧光成像数据，并在线监控全过程

6)标配台面式XYZ三轴有效行程：X轴80cm，Y轴有效扫描长度180cm，Z轴可升降范围30cm

7)400-1000nm高光谱成像：

a)光谱通道448，具备MROI功能，根据需求自由选择感兴趣光谱波段，减少数据冗余

b)帧率：330FPS（满帧），适应多种测量场景，尤其对容易摆动的植物，保证最 佳的成像效果

c)光谱分辨率 FWHM：5.5nmd)空间分辨率：1024像素

e)信噪比400:1

f)分析参数：可成像测量分析作物生化、生理指标如叶绿素含量、花青素含量、胡萝卜素含量、光利用效率、叶绿素荧光指数、健康指数、覆盖度等近百种参数

8)900-1700nm高光谱成像：

a)光谱通道224，具备MROI功能，根据需求自由选择感兴趣光谱波段，减少数据冗余

b)帧率：670FPS（满帧）

c)光谱分辨率 FWHM：8nmd)空间分辨率：640像素

e)信噪比1000:1f)分析参数：可成像测量分析NDNI归一化N指数、NDWI归一化水指数、MSI水分胁迫指数等

9)SpectrAPP®高光谱成像分析软件：

a)具备伪彩色/灰度显示、波段融合、ROI选区、光谱指数分析、光谱曲线绘制、光谱特征统计、直方图统计、结果图/表导出等功能

b)可分析NDVI、PRI、DCNI、CRI、ARI、PSRI、NPQI、EVI、HI、WBI等数十种光谱指数，可根据需求定制添加光谱指数  

左：SpectrAPP®高光谱成像分析，右：绿豆幼苗叶绿素荧光成像分析

10)Thermo-RGB成像：

a)可见光-红外热成像双镜头主机，出厂黑体多点校准并附校准证书，分辨率640×512像素

b)测量温度范围-25℃－150℃，灵敏度0.03℃@30℃，

c)红外热成像分析软件具备调色板、差值技术、温度范围设置、等温线模式、选区分析、温度扫描、剖面温度、时间图、3D温度图、在线报告等功能d)Thermo-RGB©成像融合分析：可进行手动/自动ROI分析；光照/背光叶片长度、宽度、周长、凸包面积、圆度等形态分析；最 高、最 低、平均温度、最 大温差、中位数等温度分析；R/G/B、H/S/V、绿视率等颜色分析，具备温度直方图统计、路劲分析、温度转换、图/表导出等功能e) Thermo-RGB遥控并可在线图像无线传输，实时监测RGB及红外热成像画面，测量最 大、最 小、中心点温度信息等

11)叶绿素荧光成像：

a)专业高灵敏度叶绿素荧光成像CCD，帧频50fps，分辨率720×560像素，像素大小8.6×8.3µm

b)3色4组LED激发光源：620nm脉冲调制测量光，620nm红色、5700K白色双色光化学光源，735nm远红光用于测量Fo’等

c)光化学光最 大1000µmol.m-2. s-1可调，饱和脉冲3900µmol.m-2. s-1

d)可自动运行Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭分析、光响应曲线等protocols

e)50多个叶绿素荧光自动测量分析参数，包括：Fv/Fm、Fv’/Fm’、Y(II)、NPQ、qN、qP、Rfd、ETR等，自动形成叶绿素荧光参数图

f) 自动同步显示叶绿素荧光参数及参数图、叶绿素荧光动态曲线、叶绿素荧光参数频率直方图

g) 可通过注册定位自动精 准定位运行叶绿素荧光成像分析，单次成像面积35x46mm

h)可对植物叶片、果实等不同组织进行叶绿素荧光成像分析

i) 可选配GFP成像

j) 配备便携支架和叶夹，方便独立使用

尊敬的老师：

您好！我们诚挚地邀请您参加 5 月 26 日在上海举办的高内涵成像技术与应用研讨会。本次应用研讨会旨在与科学家面对面的交流，分享使用高内涵成像和分析技术的经验，期望为相关研究领域提供有用的信息，拓展思路。

高内涵成像分析系统是一种集高分辨率、自动化、智能化、高通量于一体的通用检测技术平台，其为细胞水平的研究分析提供了高效的解决方案，是创新药物研究、中药药效、肿瘤研究、神经生物学、免疫学、干细胞研究等领域的重要研究工具。此次会议我们邀请企业、科研等专家学者共聚一堂，带来 ImageXpress 高内涵成像分析系统在各研究领域最 新进展和应用。

我们期待您的参与，并再次感谢您的关注和支持！

美谷分子仪器（上海）有限公司

时间

2023 年 5 月 26 日

地点：

上海浦东由由喜来登大酒店（上海市浦东新区浦建路 38 号）

推荐到达方式：

地铁 4 号线塘桥站 3 号口右转 20 米

报名方式：

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