Western blot化学发光(ECL)时，出现非特异条带，应该怎么办？

Western Blot 是一种用于检测蛋白质以及蛋白质翻译后修饰的常用方法，可以对简单或复杂生物样品中的目标蛋白质进行半定量或定量分析。其操作步骤包括：

•从细胞、组织或体液中制备样品（蛋白质提取和蛋白质浓度测量）

•十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶通过电泳按大小分离蛋白质

•将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上

•封闭膜上的非特异性蛋白

•用特异性一抗探测靶蛋白

•与标记的化学发光或荧光分子偶联的二抗共孵育

•检测反映抗原/抗体结合的信号

•使用软件对目标蛋白条带进行光密度分析

Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中Z常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程，因此任何一个步骤发生错误，都会导致的结果发生变异，从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明，Western Blot的一些关键步骤，例如样品制备方法、跑胶、转膜、抗体的选择以及定量所用的归一化方法，对于可再现的蛋白质印迹结果至关重要。

--样品制备--

Western blot步骤中的一个经常被忽视的方面是有效的样品制备。有效的蛋白质提取和纯化步骤对蛋白质印迹实验的结果和解释有重要影响。为了有效地提取蛋白质，应该选择一种合适的均质化方法，该方法可以通过细胞膜的破裂有效地释放细胞内的内容物。另外，应该选择Z佳的裂解缓冲液以促进蛋白质的正确溶解并防止蛋白水解降解，从而获得大量的目标蛋白质。

样品制备的原则

•尽可能采取简单方法，避免蛋白丢失；

•尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解；

•细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶YZ剂防止蛋白降解；

•提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性；

•防止发生人为的蛋白质样品化学修饰（例如加入尿素不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白）；

•尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白；

•样品裂解液新鲜配置，并分装冻存于-80℃。勿反复冻融；

•制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。

蛋白样品的类型

可溶性蛋白：

•培养细胞中可溶性蛋白，包括：细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。

•自然宿主细胞中可溶性蛋白，包括：微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。

不溶性蛋白：

•含包涵体的不溶性蛋白

•膜相关蛋白和难溶性蛋白（非重组蛋白）

蛋白样品制备的流程

•组织、细胞或菌体的破碎和裂解

•沉淀溶液中蛋白

•清除杂质

•蛋白浓缩、纯化

组织或细胞破碎和裂解

为了全面分析细胞内的蛋白，需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解，其方法取决于蛋白样品的来源。同时，因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来，从而导致蛋白降解，影响后续实验结果，因此需要加入蛋白酶YZ剂进行保护。

破碎裂解的方法

温和破碎裂解法（针对组分单一或者分析某一特定组分）：

•渗透裂解（血细胞、组织培养细胞）：将细胞悬浮于渗透溶液中，细胞因肿胀而释放细胞内容物。

•冻融裂解（细菌细胞、组织培养细胞）：反复冻融裂解细胞，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度ZG引起肿胀，使细胞结构破碎。

•裂解液裂解（组织、培养细胞）：含有去污剂的裂解液处理组织或细胞，使细胞膜破碎，细胞内容物释放出来。

•酶裂解（植物、细菌、真菌细胞）：利用酶裂解含有细胞壁的细胞。

•剧烈破碎裂解法（难于破碎细胞：固体组织、坚硬细胞壁）：

•超声裂解（悬浮细胞）：利用超声波产生的切应力来裂解细胞，超声时应在冰上间歇进行。

•弗氏细胞压碎器裂解（含有细胞壁的细胞）：细胞悬液置于高压下QL挤出小孔，压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。

•机械匀浆裂解（固体组织、细胞悬液）：将组织剪成小块，利用匀浆器在加蛋白酶YZ剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。

•研磨法（固定组织、微生物）：样品冻存在液氮中，利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。

玻璃珠匀浆裂解（含有细胞壁的细胞）：利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁，从而释放细胞的内容物。

裂解液一般组成

•缓冲液（Tris-HCl）：提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。

•去污剂（表面活性剂）：破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。

•蛋白酶YZ剂：YZ蛋白酶的活性，防止蛋白被水解。

•磷酸酶YZ剂：YZ磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化。

•还原剂：二硫键断裂和蛋白质变性

•其它：NaCl，促进细胞膜破裂使蛋白溶解。

常见裂解液成份一览表

蛋白酶YZ剂的类型

常用的蛋白酶YZ剂：

丝氨酸蛋白酶YZ剂：PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin（抑肽酶）, Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）。

天冬氨酸蛋白酶YZ剂：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物。

巯基蛋白酶YZ剂：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺。

金属蛋白酶YZ剂（金属离子螯合剂）：EDTA，EGTA，塔罗肽。

（磷酸酶YZ剂：NaF、激活的原矾酸钠、焦磷酸钠、β-甘油磷酸钠。）

^{常见的蛋白酶YZ剂一览表}

参考文献：

Protein Purification and analysis: next generation Western blotting techniques, Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.

前言

       过去的一段时间里，Western blot数据被修饰，修改，拼接，重复使用等问题，导致数据可信度遭质疑，从而文章撤稿，基金撤回，成为ZG科学家内心隐隐的痛。

       如何实现Western Blot数据规范化管理，以及数据长久保存，以便随时提取数据，回应审稿人的质疑，同行的质疑，成为科研界急需解决的问题。

       Wes/Jess全自动定量western blot系统，前瞻性的解决了这些问题。

Wes/Jess技术及Compass软件的特点

       I.数据不可修改

       Wes/Jess Compass软件，符合FDA 21 CFR part 11审计追踪法规要求，保障数据不可修改，全程实验及结果可溯源。

       II.全程自动化标准化

       很多科学家重复使用Western Blot数据，是因为同一实验重复性差，万般无奈，只能将不同次实验拼接在一起。Wes/Jess全程自动化标准化，实现数据可重复，无需再拼接实验结果。

       III.全膜western Blot

       为避免作者通过剪膜来修改western blot结果，现越来越多的杂志，需要作者提供全膜的原始结果。而全膜孵育抗体，将会大幅度提高传统western blot抗体消耗，增加成本。Wes/Jess 所有实验均为全膜western，且通常只需消耗0.1-0.2ul抗体原液，大幅降低抗体成本消耗。

       IV.数据保存

       所有数据被压缩保存在数据库格式文件中，可以使用Compass软件打开，在任何时候，都可以随时提取数据。

案例分析

       现分享国际ding级期刊Nucleic Acids Research的文章：Combined deficiency of Senataxin and DNA-PKcs causes DNA damageaccumulation and neurodegeneration in spinal muscular atrophy，作者来自美国德克萨斯理工大学健康科学ZX医学院。

       慢性，低水平运动神经元生存基因（survival motor neuron (SMN)）是导致脊髓性肌萎缩（SMA）的重要因素。作者建立SMN缺失模型研究SMA发生的分子机制。文章中进行了大量的western blot实验。

结果：

1. 急性SMN缺失，引起非SMA分裂细胞DDR信号通路活化。

2. 急性SMN缺乏导致非SMA分裂细胞SETx的下调和RNA - DNA杂合物（R环）的积累。

3. 病人数据。慢性低水平SMN可引起SMA患者来源细胞SETX和磷酸dna-pkcs缺乏，R-环积聚和DNA损伤。

4. SMN或SETX在SMA患者细胞中的异位表达减少R-环积聚和挽救DNA损伤表型。

5.慢性低水平SMN可导致SMA小鼠脊髓神经元SETX缺乏、R-环积聚和DDR通路激活

6. SMN和SETX异位表达挽救SMA脊髓神经元DNA损伤和神经元变性

       文中，作者检测17个蛋白，包括内参蛋白Tubulin（55KD），SMN（40KD），DNAPKcs（450KD）及其磷酸化，CHK1（56KD）及其磷酸化，ATR（300KD）及其磷酸化，CHK2（62KD）及其磷酸化，BRCA1（220KD）及其磷酸化，ATM（350KD）及其磷酸化，H2Ax（15KD），rH2AX（15KD），SETX（35KD）。

       涉及多个200KD以上大分子量蛋白，和H2Ax小分子量蛋白检测。众所周知，大分子量蛋白质和小分子量蛋白质，是传统Western Blot技术的难题。

       作者在补充材料中提供了所有蛋白的全膜western blot结果。举几例：

       Wes/Jess实现了结果可重复，全膜，2-440KD分子量全覆盖，全程自动化，化学发光信号值定量，数据不可修改，数据溯源，是规范实验室Western Blot数据管理的新一代技术。

如需了解更多Wes/Jess技术，请联系ProteinSimpleZG

（来源：ProteinSimple）

期刊对Western Blot数据要求：

1. 内参和目的蛋白在同一张印迹膜上；

2. zuihao选择膜染色进行总蛋白归一化；

3. 如果使用看家蛋白，需要提供看家蛋白表达稳定并且不受实验条件影响的证据；

4. 成像方法的线性范围需要提供。

看家蛋白一般常用于内参质控，整张膜上的weiyi质控标准，但是看家蛋白一般表达量比较高，可能与目的蛋白不在一个线性范围内，影响定量；并且看家蛋白证明在多种实验条件下是会发生变化，例如：细胞融合，疾病和药物ZL等等，影响定量jingzhun性。

总蛋白质控直接在膜上检测总蛋白，变异性小，误差小，动态范围更宽，使用整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化，而不是单一的条带，例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推荐使用总蛋白进行归一化。

Azure可提供一站式Western Blot归一化解决方案。

提供两种总蛋白染色试剂Azure Red和TotalStainQ进行膜染色和总蛋白归一化，AzureRed适合低丰度表达样品，TotalStain更适合细胞裂解液样品。

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Azure成像系统除了可进行Western Blot成像外，功能非常强大，可进行凝胶、In cell Western孔板成像、2D和2D-DIGE、微阵列芯片、切片、动植物组织、小鼠成像、放射性同位素磷屏成像等。

细胞异质性是肿瘤研究，干细胞研究，免疫学研究的极其重要的研究方向。单细胞研究是

分析细胞异质性的主要手段。单细胞组学研究也是jing准医学首要的研究领域。

美国ProteinSimple公司首推基于芯片Western Blot技术，进行单个细胞蛋白质表达水平定

量分析系统: Milo.

Milo具有极其强大的功能：

1. 单张芯片进行1000个单细胞western blot

2. 每个单细胞可进行数十个靶蛋白检测

3. 仅需使用Western blot验证抗体，具有抗体通用性

4. 基于western blot技术，蛋白进行分离后检测，提高免疫学检测特异性

5. 全程检测只需4小时

做Western Blot的小伙伴，是不是还在为归一化方法而纠结呢？今天小编就和大家汇总一下看家蛋白和总蛋白归一化的方法。

看家蛋白归一化

使用看家蛋白的缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。如使用看家蛋白进行标准化，必须先花费时间和精力来验证内参的选择。

使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高，如果样品中的看家蛋白表达非常高，这会限制在凝胶上加载的样品量，如果感兴趣的蛋白不是同样的表达丰度，那这两种蛋白质就不在同一线性检测范围内。

如果您正在进行多重蛋白印迹，例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式，则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。

检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下，看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同，因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。当实验在同一印迹上检查多种目的蛋白时，这就变得越来越困难。

总蛋白归一化

使用总蛋白归一化，是直接在膜上检测总蛋白，并且该值在归一化时用作分母。总蛋白染色提供更宽的动态范围，并且表现出比看家蛋白更低的可变性和更准确的定量数据。

与使用看家蛋白相比，图像采集后的分析工作流程基本不变; 整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化，而不是单一的条带。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊会推荐使用总蛋白归一化方法。

使用总蛋白染色剂对膜进行染色提供了质控优势，可以验证转印是否完全。

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