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一、背景介绍

LED光源的持续发展，促进了光化学在有机合成中的应用，但想实现＞100 kg规模的光化学合成仍然存在一定困难，主要是因为传统釜内光的穿透性较差。连续流能够通过平推流或连续搅拌使得反应液能够更加接近高强度的光源，有效克服了传统反应釜的缺陷。

图1. [2 + 2]光化学环加成制备化合物2

近期，凯莱英的研究人员使用顺丁烯二酸酐（1）和乙烯进行[2 + 2]光化学环加成反应（图1），并对该工艺进行了优化放大，获得了很好的量产化结果。

二、 实验部分

首先研究人员对反应条件进行了优化，使用365 nm波长LED灯作为光源使用苯甲酮作为光敏剂，对反应溶剂进行了筛选（图2），由图中可以看出，结合转化率和选择性，丙酮是该反应的ZY溶剂。

图2. 不同溶剂对反应转化率和纯度的影响

然后对光敏剂用量进行了筛选（表1），为了平衡反应转化率和后处理重结晶效率，ZZ选择10 %摩尔当量的光敏剂用量。

表1.光敏剂用量对反应产能的影响

接着，研究人员对反应所用的管线内径、混合方式、LED光源功率等设备参数进行了研究（表2）.

表2.装置设计对反应产能的影响

ZH为了达到500 g/天产能的要求，研究人员自主搭建了一套光化学反应装置（图3）。结合之前的实验数据设定了验证性运行的具体实验条件（表3）。该系统连续运行了51 h，间隔4 h取样进行转化率和收率的检测以验证工艺的稳定性，分离收率达到91 %，产能达到646 g/天（图4）。

图3. 500克/天产能工艺试运行的流程图

表3.验证性运行的实验条件

图4. 51小时验证性运行的取样结果

三、扩展实验    

为了达到5 kg/天的目标产能，研究人员对现有装置进行了改造，并在设计过程中进行过程安全分析的考虑，通过引入PLC系统、加装气体报警传感器、加入压力传感器等措施对反应装置进行改进，以确保生产过程中的安全措施（图5）。

1. 生产装置由三个独立模块组成 （20.76 L持液体积，10 mm外径)，光源由6个3 kw 的365 nm 波长LED面板组成（图6）。

图5. 生产装置改进流程图

图6.生产规模的光化学装置实物图

2. 研究人员使用上述装置进行工程运行以验证工艺，并对反应停留时间的边界条件进行了探索（图7），由图中可以看出，当反应停留时间小于2h时，原料剩余会大于5%，因此反应停留时间需控制在2h以上。

图7.工程运行的总结

表4. 示范运行的实验条件

随后研究人员又使用该装置进行了45 h的不间断的示范性运行（表4）。ZH，研究人员使用该装置连续不间断运行了1周，经过优化，反应停留时间由原来的2 h降低至1.9 h（图8），间隔6 h取样，确保原料剩余小于5 %，经过1周的稳定运行，获得了51.8 kg的化合物2，超过了5 kg/天的生产目标，经过多批次生产共获得大于250 kg的化合物2。

图8. 批量生产化合物2的结果

四、实验总结

● 作者通过对反应条件的筛选、实验参数调整及生产前详尽的过程安全评估，完成了顺丁烯二酸酐和乙烯的[2 + 2]光化学连续流环加成反应的放大生产，并实现了大于5 kg/天的生产目标。为后继开发者提供了思路和参考

● 连续流动化学为大家拓宽了光化学合成反应的领域，帮助大家跳出釜式反应的限制。光化学反应的工业化，进步空间还很大，相信更多的研究案例会出来。

**此外：

● 从文中可以看出，小试和放大的工艺条件并不相同，也就意味着使用自制的反应器可能存在着放大效应；

● 光化学反应液浓度较稀，自制反应器会受到产能的限制；

● 康宁反应器无放大效应，从实验室小试到工业化生产可以省去中间参数重新优化以及设备更改的时间和工作量，大大提GX率和质量。

● 康宁G3光化学反应器年通量可达1000吨，满足客户不同级别的产能需求。

动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药品粒度分析技术。本技术说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。

1、方法验证

分析方法验证是证明分析程序适合其预期目的的过程5。并非所有验证特征都适用于粒度分析。较早的 FDA 工业指南（非实施）草案文7包括一个专门针对粒度分析的部分。尽管较新的已发布文件取代了较旧的指南草案，但有关粒度分析的较旧部分提供了有关粒度分析与其他技术（如 HPLC）的不同之处的见解。旧文档中的以下声明有助于方法验证工作：

“方法验证通常涉及中间精度和重复性的评估。应保证生成的数据是可重复的，并控制产品的质量。”7

考虑到这一评论，下面提供了解决 DLS 方法验证的建议

● 特异性：N/A，DLS 检测大小变化但对不同化学物质不敏感。

● 线性：N/A，DLS 没有任何线性关系。

● 准确性：N/A，仪器的准确性使用标准粒子进行验证，但缺乏公认的定量裁判方法（SEM/TEM 显微镜）不包括准确性确定。包括样品的 SEM/TEM 图像以支持方法验证可能是更合适的。

● 精密度（重复性、中间精密度和重现性）：这是需要重 点关注的地方。通常这些术语的定义在粒度分析领域可能不同于其他技术。以下评论来自粒度分析领域：

     重复性：多次测量样品。

     重现性：准备样品、测量、丢弃、清洁、重复。建议的方法是制备五份样品，然后对每个样品进行五次分析。

     中间精密度：此活动涉及第二位分析员、第二台仪器或两者兼而有之。如果所有测试都在一个地点进行，则由同一系统上的不同操作员在不同日期分析同一批次的样品。如果要在多个地点进行测试，则同一样本（或批次）由不同操作员在不同地点的不同系统上进行分析。

● 范围：N/A，仅在所用系统的工作范围内工作。无需对此进行测试或记录。

● 定量限：N/A，这只是测试粒径。

● 检测限：N/A，方法开发应确保样品在系统检测限内。

一旦一种方法得到验证，该程序就应该用于产品的生命周期。如果需要重复调整，则应重新评估和重新验证该方法。

2、结构示例

两名操作员在两个 Nicomp DLS 系统上分析了一种药物物质（异丙酚乳剂）。该样品已过期，但仍显示符合 USP <729> 的合格结果。仪器设置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3、方法开发

首先分析 92 nm PSL 标准以确保适当的系统性能。测量结果在预期值的 98% 以内。建议在开始此类工作之前进行此验证测试。

接下来进行快速研究以测试浓度（稀释）的影响。参见图 1 中的结果。

将 10 滴样品加入 15 mL 去离子水中并进行分析。重复相同的制备。然后将这些样品按 2:1 稀释并进行分析。样品看起来太浑浊，结果发生变化，因此将下一滴添加到 15 mL DI 水中。样品出现轻微混浊，这些结果是可以接受的。有时，稀盐溶液是比纯去离子水更好的稀释剂。下一步是将一滴样品加入 10 mL 过滤后的 10 mM KCl 溶液中。这些结果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他测量。

在进行稀释研究时，分析时间也从3分钟到10分钟不等。三分钟、五分钟和十分钟分析时间的时间曲线图如图2-4所示。红色=光强粒径平均值，蓝色=体积粒径平均值，蓝色=数量粒径平均值。

该方法选择了5分钟的分析时间。在五分钟的分析时间完成之前，光强平均粒径结果已经稳定下来。但直到大约9分钟前，体积和数量加权平均结果仍在变化。这是也是在使用DLS时仅选择光强粒径结果的一个原因。这可能是方法开发中测试重复性很好的一个点。在这种情况下，也许下一个测试的分析时间是四分半、五分和五分半钟。在这项研究中没有执行这一步骤，值得指出的是，整个方法开发和验证研究在不到8个小时内完成。更严格的最 终发布测试方法开发和验证方法很可能需要至少几天时间。

4、样品准备

——在干净的瓶子里装满10毫升过滤后的KCl溶液

——用针头注射器取出0.5毫升异丙酚

——在瓶子里注入1滴异丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋转直到完全混合(10秒)

——用一次性移液管将400μL样品移入圆形一次性玻璃样品池

——将玻璃样品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打开样品盖

——将样品池和支架插入Nicomp系统，Holder支架背向Nicomp的左侧

——关闭Nicomp上的样品盖

确保仪器设置与如下所示的值匹配：

——单击绿色“G”图标开始测量

——打印并记录平均直径、标准偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——将结果输入 Excel 电子表格

——计算五项分析的平均值和变异系数

——比较两个数据集

5、结果

样品在 A 和 B 系统上独立制备和分析。每个样品分析五次以检查重复性。这两个系统的示例结果如图 5 和图 6 所示。

整个结果以表格形式显示在图 7 和图 8 中。五个结果的叠加如图所示。

6、结论

查看综合结果可以得出以下几点观察结果：

——即使是相隔数年生产的两个系统也会生成相似的数据

——两个系统之间存在明显的 3% 偏差

——PI计算可能不是用于定义宽度分布的最 佳值

——如果使用PI，则30%的差值似乎是合适的

——D10、D50、D90 结果显示出更好的重现性，可能更容易为制药行业所接受

纯粹基于该数据集，基于三个测量的该药物产品的规格可能类似于：

——光强平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建议规格仅来自观察到的重现性，可能对药物安全性或有效性没有任何影响。USP <729> 中的实际是否通过标准的要求只是粒径尺寸必须低于 500 nm 并且具有低x2值。质量标准的另一种方法可能是关注影响有效性和/或安全性的粒径大小。本技术说明收集的数据是让您了解 DLS 技术对于简单样品的可重复性/重现性

7、仪器介绍

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

高斯粒径分布图                         多峰粒径分布图 

参考资料

1 USP <729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions,http://www.usp.org/

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS),https://www.iso.org/home.html

3 USP <429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size,http://www.usp.org/

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015,https://www.fda.gov/media/87801/download

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods

Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation

动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药物粒度分析技术。本技术说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。

1、引言

虽然 DLS 在制药行业广泛使用，但关于方法开发和验证主题的文章很少。唯 一提及 DLS 的药典测试是 USP <729>脂质注射乳剂中的球体大小分布。1 因此，本文提供了有关在制药行业中使用 DLS 的一些见解。

2、USP<729>

此标准要求使用 100、250 和 400 nm 三个尺寸规格的 PSL 标准粒子来验证 DLS 系统。本文作者不理解为什么选择这些粒径，尤其是合格/不合格的标准是 500 nm。

许多使用DLS 的专家认为，仅以一种粒径进行测试应该即可验证系统是否正常运行。对这些标准进行3次测量，强度加权平均粒径和标准偏差应与预期值在可接受的误差范围内一致。而可接受的度是根据“在可接受的误差范围内”给出的。也许平均粒径在 ±10% 的范围内是合理的。

系统适用性部分指出，如果 CV 不超过 10%，则分析标准品时的重现性符合标准。通过 USP <729> 测试要求强度平均粒径小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低”。Nicomp® 用户手册指出，良好的高斯结果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值 <3 表示通过结果。

3、质量标准说明

因为USP <729> 测试是唯 一使用 DLS 的药典专著，其质量标准设定值得考虑，但药典质量标准不一定适合所有药物。一种更常见的规范方法是定义强度平均值的值和范围以及与分布宽度相关的一些计算。DLS 的 ISO 标准建议关注强度平均值和多分散性指数(PI)。2

作者看到的一些 DLS 规格包括 D10、D50 和 D90 的值。这些值可能来自制药行业广泛使用激光衍射进行粒度分析。USP <429> 测试光衍射测量粒径3经常使用 D10、D50 和 D90。设置质量标准的另一种方法是从USP<429>中借鉴重现性相关内容， USP <429> 中“重复”部分给出的基于体积分布的重现性范围为：

● D50 = 10%

● D10, D90 = 15%

● 在 10 µm 以下，这些最 大值可以加倍

遵循这些指南的内容，DLS 规格（根据定义尺寸小于 10 µm）对于强度平均值可以是可重复的 ±20%，对于 PI 或其他计算结果指示分布宽度是可重复的 ±30%。对于某些药品，这可能是一个可以接受的范围，但要注意当粒径非常小时出现的统计问题。如果平均粒径为 500 nm，±20%，则范围为 400 – 600 nm，这还不错。但对于平均粒径为 10 nm 的蛋白质，范围则为 8-12 nm，这样的粒径跨度变得非常挑战且难以接受。

4、方法开发

在开发方法之前，需要调查样品制备问题。这可以从简单的（将样品移入比色皿中）到复杂的（用表面活性剂和超声波分散）。样品制备的主题超出了本文档的范围，但已在之前的技术说明中讨论过。4 使用 DLS 制备样品进行分析时需要考虑的一些建议包括：

—— 测试浓度的影响。测量、稀释并再次测量。

—— 测试测量时间的影响。测量 3、5 和 10 分钟。

—— 确保任何稀释剂都经过充分过滤。WFI 可能不够干净。

—— 确保使用样品池都足够干净。

—— 是否应使用过滤器去除样品中的大颗粒？

—— 哪个样品池合适。

—— 调查任何可能影响结果的仪器设置。

优化样品制备步骤和仪器设置后，就可进行测试重复性实验。调查分析时间的微小变化是否对结果有任何重大影响。如果该方法需要 5 分钟的分析时间，则在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒时测试。检查结果是否相同。

一旦方法得到优化，下一步就是按照标准 FDA 指南记录该方法。5 目标是足够详细地描述程序，以便其他操作员可以执行相同的测试并生成相同的结果。列出了必须包含的基本信息：

—— 原理/范围：分析测试/技术的基本原理。

—— 装置/设备：仪器类型、激光、检测器、检测角度和样品池类型。

—— 操作参数：温度、粘度、分析时间和通道宽度。

—— 试剂/标准品：用于验证性能的聚苯乙烯乳胶 (PSL)。PSS 建议使用 90 nm PSL（请参阅 Entegris 技术说明 - 系统验证）。

—— 标准控制溶液制备：稀释剂，稀释。6 

—— 程序：程序的逐步描述。将准备好的样品放入比色皿中，放入到系统中，定义参数并进行测量。

—— 系统适用性：测试以确保系统在使用时能够正常运行。6

—— 计算：所有结果计算通常直接在DLS 系统操作系统软件中进行。8 可以在电子表格中进行额外的统计计算。

—— 数据报告：数字数据、格式、有效数字的表示。Entegris 建议将结果重 点放在光强强度加权平均直径上。

5、关于参考标准和材料的说明

如上所述，我们认为单个粒径的测试足以验证系统是否正常运行。多家供应商提供多种粒径标准品，客户可以选择他们推荐使用的样品。但Entegris对两种 PSL 标准粒子拥有丰富经验，这些也是我们通常建议客户用来验证其 Nicomp6 的样本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 标称 PSL 标准通常用于验证 Nicomp 性能。样品的目录号为 3090A，认证值为 92 ± 3 nm。另一个经常使用的样品是 Thermo Fisher 目录号 5009A，值为 90 nm。该样品不可追溯到 NIST，但我们有足够的经验推荐使用该样品，而且它比 3000 系列产品便宜。

注：DLS 是一种不需要校准的第 一原理技术。该系统使用一种或多种 PSL 标准进行验证。如果系统未通过验证步骤，则无法进行调整以使结果进入预期范围。验证结果失败可能是由于系统工作不正常而需要维修，或者更常见的是标准粒子准备不当，应在尝试另一次测量之前重新准备。

6、仪器介绍

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

高斯粒径分布图                     多峰粒径分布图

参考资料

1 USP <729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions,http://www.usp.org/

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS),https://www.iso.org/home.html

3 USP <429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size,http://www.usp.org/

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015,https://www.fda.gov/media/87801/download

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods

Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation