核酸电泳的注意事项

p853c54r5 2013-08-16 12:44:18 558 浏览

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引堪怯184 2013-08-17 00:00:00

1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3. 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。 4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。回收率低或为零 1. 漂洗缓冲液中没加入乙醇.在使用前应确保乙醇已加入漂洗液PW中。 2. 吸附材料上有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，因含乙醇会降低洗脱效率。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。 3. 洗脱缓冲液pH值偏低.DNA只在低盐buffer中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl， pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。Z大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。 4. 洗脱液加入位置不正确.洗脱液应加在硅胶膜ZX部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面，达到Z大洗脱效率。 DNA质量不好洗脱产物含有乙醇残留.洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液

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核酸电泳的注意事项:

关于核酸电泳的bp估算: 我在跑DNA双链电泳中条带在750bp的位置，请问这表示有DNA双链有750对碱基吗，也就是说双链共有1500个碱基，是不是这么算的要乘2的，如果是单链DNA呢，就是表示共有750个碱基吗，如果我不知道是双链还是单链，不是没辙了?不知道我哪里想错了，有懂的吗

关于核酸电泳的bp估算: 我在跑DNA双链电泳中条带在750bp Marker的位置，请问这表示有DNA双链有750对碱基吗，也就是说双链共有1500个碱基，是不是这么算的要乘2的，如果是单链DNA呢，就是表示共有750个碱基吗，如果我不知道是双链还是单链，不是没辙了?不知道我哪里想错了，但我看到有... 我在跑DNA双链电泳中条带在750bp Marker的位置，请问这表示有DNA双链有750对碱基吗，也就是说双链共有1500个碱基，是不是这么算的要乘2的，如果是单链DNA呢，就是表示共有750个碱基吗，如果我不知道是双链还是单链，不是没辙了?不知道我哪里想错了，但我看到有的文章就是根据电泳估算核酸大小确定病毒种类，病毒也分单链和双链的呀，他们怎么知道的，有懂的吗展开

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核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，而电泳的质量直接决定了后续实验的成败，实验室常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶作为支持物。琼脂糖凝胶是一种聚合链线性分子含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺在在催化物催化条件下聚合形成长链，并通过亚甲双丙烯酰胺交叉连接形成网孔，网孔的大小由丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。电泳就是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以核酸分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-9.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此净电荷对泳动速度影响不大，使得它们能以同样的速率向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同，如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA＞IDNA＞ocDNA。

琼脂糖凝胶适合分离长度100bp至20kb的分子，聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果zui好。

琼脂糖凝胶形成过程

琼脂糖凝胶

丙烯酰胺分子式

N,N’-亚甲双丙烯酰胺

聚丙烯酰胺网状结构

聚丙烯酰胺凝胶

影响核酸分子泳动率的因素主要有：

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度越大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其涌动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA。

2、电场强度

电场强度越大，带电离子的泳动越快，但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，对于大片段分子的话，则需要更小的电压。

3、缓冲液离子强度

缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低时，pH会偏大，缓冲能力减弱，会影响电泳效果。

相信很多实验人员平时跑电泳的时候会遇到很多问题，配胶步骤繁琐、染料有毒、分辨率低、电压选择不当等都会极大的降低我们的工作效率。随着科技的发展，其实我们还有其它选择，那就是毛细管电泳仪，ZG台湾Bioptic公司推出的便携式毛细管电泳仪——Qsep1 lite，这款仪器轻巧、简便、易操作；采用预制胶卡夹、即插即用、安全无毒；检测快速，最快可达到1分钟内/样本；灵敏度可达到pg级别，样品消耗只需1微升。可用于PCR产物分析、物种遗传多样性检测、核酸质检、质粒DNA酶切构造及纯度分析、文库质控、RNA质控等多种实验。

Qsep1 lite

毛细管电泳原理示意图

PCR产物分析对比图

RNA质控

酶切产物

2020-10-12 15:38:30 726 0

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核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，而电泳的质量直接决定了后续实验的成败，实验室常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶作为支持物。琼脂糖凝胶是一种聚合链线性分子含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺在在催化物催化条件下聚合形成长链，并通过亚甲双丙烯酰胺交叉连接形成网孔，网孔的大小由丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。电泳就是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以核酸分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-9.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此净电荷对泳动速度影响不大，使得它们能以同样的速率向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同，如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA＞IDNA＞ocDNA。

琼脂糖凝胶适合分离长度100bp至20kb的分子，聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果Z好。