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- 怀偈炕 2012-11-02 00:00:00
- EB、Cyber Green
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- keyso888 2012-10-31 00:00:00
- 电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂： 1、溴化乙锭（ethidium bromide， EB） Z常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。 在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4℃避光保存， 2、吖啶橙（acridine orange， AO）： 吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。 3、银（Ag+）试剂： Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。 4、亚甲蓝（methylene blue） 可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，Z低检测量为 250ng。
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核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，而电泳的质量直接决定了后续实验的成败，实验室常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法以琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶作为支持物。琼脂糖凝胶是一种聚合链线性分子含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺在在催化物催化条件下聚合形成长链，并通过亚甲双丙烯酰胺交叉连接形成网孔，网孔的大小由丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的相对比例决定。电泳就是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以核酸分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-9.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此净电荷对泳动速度影响不大，使得它们能以同样的速率向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同，如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA＞IDNA＞ocDNA。琼脂糖凝胶适合分离长度100bp至20kb的分子，聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果zui好。
琼脂糖凝胶形成过程
琼脂糖凝胶
丙烯酰胺分子式
N,N’-亚甲双丙烯酰胺
聚丙烯酰胺网状结构
聚丙烯酰胺凝胶
影响核酸分子泳动率的因素主要有：
1、样品的物理性状
即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度越大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其涌动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA。
2、电场强度
电场强度越大，带电离子的泳动越快，但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，对于大片段分子的话，则需要更小的电压。
3、缓冲液离子强度
缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低时，pH会偏大，缓冲能力减弱，会影响电泳效果。
相信很多实验人员平时跑电泳的时候会遇到很多问题，配胶步骤繁琐、染料有毒、分辨率低、电压选择不当等都会极大的降低我们的工作效率。随着科技的发展，其实我们还有其它选择，那就是毛细管电泳仪，ZG台湾Bioptic公司推出的便携式毛细管电泳仪——Qsep1 lite，这款仪器轻巧、简便、易操作；采用预制胶卡夹、即插即用、安全无毒；检测快速，最快可达到1分钟内/样本；灵敏度可达到pg级别，样品消耗只需1微升。可用于PCR产物分析、物种遗传多样性检测、核酸质检、质粒DNA酶切构造及纯度分析、文库质控、RNA质控等多种实验。
Qsep1 lite
毛细管电泳原理示意图
PCR产物分析对比图
RNA质控
酶切产物
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沪公网安备 31011502008050号
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