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生物大分子药物目前主要包括治 疗性蛋白药物与核酸药物等，随着生物技术的迅速发展，生物大分子已被普遍用以治 疗肿瘤、本身免疫系统疾病和遗传代谢病等多种疾病。生物治 疗药物在临床和商业上的成功引起了行业内对其开发的日益重视，需要高质量的生物分析来支持这些药物的开发。

与常规药物一样，评估大分子药物的安全性和有效性需要彻底了解其药代动力学（PK）、药效学（PD）、毒代动力学（TK）以及免疫原性等特征。在药物与机体相互作用中，PK是研究机体对药物的处置作用，而PD和TK是分别研究药物对机体有益/有害的效应。PD/PK和PK/TK的相互关系是药物药理学评价的核心。FDA、NMPA等监管机构要求药物进入临床前必须证明其有效性和安全性，临床前和临床研究均需要研究药物的PK，同时FDA建议对免疫原性风险检测最 好在IND阶段和临床I期开展。因此，建立好的PD/PK/TK等生物分析方案对于大分子药物的临床前及临床分析评价极为重要。

与小分子药物相比，大分子药物具有分子量大、结构复杂、细胞外基质不容易透过、使用量低、身体易溶解等特性，其生物分析充满挑战。

生物大分子药物与传统小分子药物的药代动力学

特征比较（药学进展 ，2018年8期 ）

传统的生物分析方法通常依赖于基于小分子检测的液质联用系统和基于生物制剂的配体结合分析（ligand-binding assay，LBA)），目前这两种方法也用于抗体等生物药的生物分析中。在现在的创新药物中，还有mRNA、病毒载体、细胞治 疗产品等，这些药物本质上并非蛋白质药物，因此qPCR、流式细胞术、成像技术等手段也越来越多地用于生物药的生物分析中。

01、基于配体结合分析

生物分析中基于配体结合分析LBA是一种常用的分析工具，用于根据与其他生物分子的相互结合作用（binding interaction），定量测定生物分子（目标分析物，Analyte）在生物体液中的浓度，主要包括酶联免疫(ELISA)等。

目前ELISA是生物制药行业使用最广泛的配体结合式（LBA）检测平台，它一直以来都是蛋白质定量分析最常用的技术，现在大多数生物标志物的商业检测试剂盒都是基于ELISA的。这项技术对于某些临床前生物分析的应用仍然很有吸引力，比如血清单克隆抗体的PK。但是ELISA操作复杂、测试运行时间长，采用自动化平台可缩短分析人员操作的时间， 提高工作效率。

丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特的Biomek i7自动化工作站结合美谷分子仪器的SpectraMax i3 多功能酶标仪，可以自动化地对样本进行高通量的ELISA操作，大大避免实验误差及重复的人工劳动。

自动化工作站进行ELISA实验流程

自动化工作站进行ELISA实验的结果

02、液相色谱串联质谱检测系统LC-MS/MS

与LBA 相比，LC-MS/MS 在生物分析中的优势在于可以提供快速的方法开发和验证、高特异性和高重现性，还可以实现多种分析物同时定量。另外，LC-MS/MS 方法也更容易在不同的分析物类别和基质之间转移。但是灵敏度、样品制备、方法开发和定量准确度相关的难题也亟需解决。

丹纳赫生命科学旗下SCIEX开发了一种通用的混合LBA和LC-MS/MS两种技术的工作流程，该工作流程结合了这两种技术的优势，可用于蛋白质药物的PK分析。该方法检测阿达木单抗在小鼠血浆中的浓度，先用磁珠方法进行免疫亲和性样品的制备，然后将阿巴利单抗标准品进行消化后进入TripleTOF™ MS系统进行肽图谱分析，用以选择蛋白质定量的特征性肽段。在QTRAP 6500+系统进行定量分析后，50 到 10000 ng/mL 的线性关系可达0.99763，定量限为50 ng/mL。

LC-MS/MS方法的前处理流程

阿达木单抗的提取离子色谱图   

SCIEX QTRAP™ 6500+ 系统

03、qPCR技术

qPCR法是常用的分析核酸药物表达量的一种方法，其定量下限可以达到pg/mL甚至fg/mL，这可以极大增强药物在体内暴露的检测时间。此外，RT-qPCR使用的样本量极少，只需要几微升血浆样本或1毫克组织即可满足分析需求，减少了对珍贵样本的使用，而且能够使用384孔板实现对样本的高通量分析。然而获得信号特异、低背景的qPCR结果也非易事，丹纳赫生命科学旗下IDT埃德特的双淬灭荧光探针，在靠近报告基团9bp左右的位置增加一个中间淬灭基团，为FRET作用中提供了一个能量的“中转站”，拉近了能量传递中每个基团间的距离，从而提高了荧光淬灭率降低了背景信号。

IDT 双淬灭荧光探针示意图

（蓝色序列片段即为双淬灭荧光探针）

在过去20年中，新型治 疗方式的出现改变了生物分析领域的现状，导致了一系列技术的发展和成熟。在发现阶段以及药物开发的临床前和临床阶段，健全的生物分析方法非常重要，这将有助于开发更安全、更有效的药物，同时减少开发的时间和成本。丹纳赫生命科学一系列先进的生物分析工具和方法能够有效帮助应对创新药物复杂结构和不同作用机制对PK、PD和免疫原性评估提出的重大挑战。

近期爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19，对应的病毒为SARS-CoV-2）突出了开发有效ZL方法的重要性。在近期的公众号中，我们向大家介绍了“人民的希望”瑞德西韦的工作机制^[1]，在此，我们结合疫苗、血清、多肽和单抗的研究案例，向大家继续介绍靶向病毒的大分子ZL和我们的解决方案是如何推动下一代ZL研究的。

No.1针对MERS的疫苗优化研究

中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，是近年来第二个造成大规模人群传染的冠状病毒，相较于SARS病毒，其致死率高、发病快，因此急需研发有效的疫苗用于被动免疫。在2015年由NIH的Barney S. Graham主导的研究中，科学家评价和比较了靶向MERS的多种疫苗方案^[2]。

基于DNA和蛋白为免疫原的免疫流程，图片源自参考资料2。

围绕MERS冠状病毒的刺突蛋白(S)，研究构建了多种cDNA和蛋白免疫原，分别通过电转和配合佐剂的形式免疫小鼠。为了提升研究的安全性，科学家建立了带有化学发光报告基因的假病毒体系。通过检测由病毒感染所致的化学发光，研究利用可溶性DPP4（MERS 靶点）和DPP4抗体验证了假病毒的功能。

MERS假病毒功能性验证，左图：基于过表达技术验证DPP4过表达提升病毒的感染能力，Huh7.5内源性高表达DPP4。中图：基于可溶性DPP4的竞争实验。右图：利用DPP4抗体YZ假病毒的感染。假病毒的化学发光检测基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平台。图片源自参考资料2。

借助假病毒体系，研究追踪和评价了不同免疫策略产生的血清的中和能力和针对多种MERS病毒株的交叉中和能力。从结果可以看出，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案所获得的抗体Z为有效，且能中和多种MERS病毒株。通过进一步的竞争实验和血清吸附实验，研究证实不同的免疫流程得到的血清靶向的S蛋白位置也不一样。与经典的微量中和实验(Microneutralization)相比，研究证实假病毒体系评价抗体中和能力更为敏感，灵敏度约有一个数量级的提升。通过解析抗体的亚型，研究发现基于S DNA的免疫方案能诱导IgG2a为主导的免疫反应，而S1蛋白刺激则产生IgG1为主导的免疫反应。在小鼠中，IgG2a的出现反映了Th1型免疫反应，促进了抗病毒相关因子如interferon-γ的释放，提升了T细胞介导的抗病毒反应。因此，相较于蛋白，基于DNA的疫苗可以通过建立T辅助细胞免疫应答来更有效的控制病毒感染。

血清的交叉中和能力检测。假病毒的化学发光检测基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平台。图片源自参考资料2。

对应的，在非人灵长类动物（印度恒河猴）模型上，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案产生的中和抗体滴度优越于基于全程DNA的免疫方案。病毒接种后，相较于对照组，免疫组动物显著降低肺部病理指标。疫苗中DNA免疫原的引入更是进一步缓解肺部的损伤情况，并加速了康复过程。

基于非人灵长类动物（印度恒河猴）模型的疫苗评价。上图：免疫流程。下左图：动物血清中和实验，基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平台。下右图：通过CT评价疫苗的保护作用。图片源自参考资料2。

No.2基于转基因牛的抗病毒血清研究

在抗击SARS和流感的临床疗法中，“恢复期血浆”ZL(Convalescent‑phase plasma therapy)获得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，该法的LX很大程度上依赖于是否能及时获得有效的血清。相比下，基于动物的超免疫血清虽然能解决量的问题，但其使用可能会导致严重的免疫反应和毒性。单克隆抗体疗法，又一种基于被动免疫的ZL方法，面临耗时长和出现耐药突变病毒株等挑战。

为了解决上述的问题，有研究人员将目光转向了转基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)来快速获得大量、有效的抗病毒血清。通过基因工程，研究人员敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可指定IgG亚型人抗体表达体系，来达到免疫系统人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高达150到600 g的人IgG。目前，已有多项临床前研究利用该技术对抗MERS和Ebola等传染病^[3,4]。在此，我们着重介绍靶向MERS的研究。

在免疫原段，该研究利用了两种材料：灭活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的纳米材料(SPNV)。两种免疫原均能刺激产生S蛋白特异的血清和人IgG(SAB-300/301)。基于安全性和生产可行性等因素，研究主要围绕基于SPNV产生的人IgG开展动物和临床研究。

上图：基于转基因牛的免疫过程。下图：利用Anti-Spike抗体检测所得血清（左）和纯化人IgG（右）的有效含量。图片源自参考资料3。

除了特异性检测外，研究利用免疫荧光成像技术，结合Anti-Spike抗体来衡量免疫所得血清和抗体的抗病毒中和作用(FRNA50)。相较于只能完成一轮感染的假病毒体系，FRNA50能直观、全面地反映药物处理对于病毒感染能力的影响。在该研究中，此法还结合mRNA检测验证病毒的灭活效果，确保疫苗的安全性。结合FRNA50和传统的半数组织培养感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)测定法，研究证明纯化的血清含有高水平的中和多抗。在过表达DPP4的小鼠模型上，无论是预防性还是ZL性给药，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗体依赖的病毒感染增强作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已进入一期临床试验。

利用FRNA50检测所得血清（左）和纯化人IgG（右）靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高内涵平台和配套微孔板。图片源自参考资料3。

No.3利用ADCC抗击H7N9禽流感的单抗研究

作为肿瘤免疫疗法的主要推动者，单克隆抗体（单抗）也被广泛用于抗击SARS和HIV等多种病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和单抗的研究也为疫苗设计提供了新的思路。但是，基于杂交瘤技术的传统单抗制备面临着耗时长，步骤多且繁琐等问题，限制了其对可能出现的新型疫情爆发的应对能力。相比下，噬菌体展示技术为快读获得高亲和力人源单抗提供了新的途径。基于该技术平台，复旦大学研究人员建立超大型天然全人源抗体库，并成功鉴定靶向MERS和流感的QL抗体^[5,6]。

在抗击H7N9流感的工作中，为了获得低突变的高特异抗体，研究人员以重组表达的HA和HA1蛋白为抗原，基于健康人B细胞来源的天然抗体库开展多轮筛选，获得单抗m826。经序列分析，研究人员证明m826与胚系基因高度同源，是胚系抗体。相较于体细胞高度突变的抗体，胚系抗体建立时间短，安全性高且成药性更好，适用于靶向急性感染的抗体和疫苗研发。

基于噬菌体展示技术的H7N9抗体筛选，图片源自参考资料6。

非常有意思的是，在红细胞凝集YZ (Hemagglutination inhibition,HI)反应中，m826仅表现出微弱的抗病毒能力。进一步的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)检测和免疫荧光法中和实验证明m826不能中和流感病毒，YZ其在靶细胞的增殖。利用亲脂性荧光染料R18和SP-DiOC18（3）来标记病毒，研究发现m826对病毒与靶细胞的结合和膜融合过程无显著影响。但是，m826能很强结合表达H7N9 HA蛋白的细胞，是ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）活力的QL介导者。同时，由于不能中和H7N9病毒，m826还能成为高价值的工具性抗体。在动物模型上，IgG1 m826能有效的预防和控制H7N9的感染。因此，m826依赖于ADCC，而不是中和能力抗击流感病毒。这一发现为抗病毒抗体的筛选和研发提供了新的思路和途径。

左图：基于免疫荧光成像技术（荧光标记病毒）的中和实验，H7N4抗体为中和阳性对照。右上：病毒结合检测，红色荧光探针R18标记病毒，感染30分钟后进行成像检测。NA为结合阴性对照；m336为阴性对照抗体。右下：利用荧光探针R18和SP-DiOC18（3）双标记病毒，病毒膜融合发生会诱导SP-DiOC18（3）绿色荧光信号加强。Baf A1为融合阴性对照。上述高通量成像检测均基于Opera或Operetta高内涵平台。图片源自参考资料6。

No.4靶向膜融合的广谱抗病毒多肽研究

作为动物来源的病毒，冠状病毒因其多样性，较高的传播能力和进化能力限制了单一的靶向疗法的临床应用。因此，从长远角度来看，能作用于多种冠状病毒的新型广谱抗病毒 药物，会成为抗击流行性和新型冠状病毒感染的终 极武器。相较于高度变异的受体结合区(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)区高度保守。同时膜融合也是病毒感染和复制重要的功能性过程。因此，该区域成为了YZ性多肽的研究ZD。靶向冠状病毒的膜融合过程，来自于复旦大学的研究团队研发出广谱多肽YZ剂EK1，为抗击冠状病毒和类似病毒提供了新的大分子ZL策略^[7]。

冠状病毒可通过胞内体膜融合途径(Endosomal pathway)或/和细胞表面胞浆膜融合途径(Non-endosomal pathway)进入细胞。病毒通过结合宿主细胞受体激活其S2亚基的HR1和HR2区，互相结合形成对膜融合至关重要的6-HB(Six-helix bundle)结构。

冠状病毒的膜融合过程和竞争性多肽工作机制，图片源自参考资料7。

鉴于此，研究人员以多种冠状病毒的保守HR区为模板，合成HR1和HR2区来源的多肽（HR1P和HR2P）用于竞争。通过过表达技术，研究进一步建立靶向多种冠状病毒的细胞细胞融合实验，系统性筛查HR1P和HR2P对细胞融合的YZ。结果显示由OC43株来源的HR2P具有广谱且的YZ融合能力。在此基础上，研究人员通过引入氨基酸和突变等方法，进一步优化多肽的可溶性和成药性。所获得的多肽EK1，在进一步的一系列体外检测，包括细胞细胞融合实验，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力检测中，都表现出的广谱抗病毒能力。

细胞细胞融合实验，过表达病毒S蛋白并带有GFP信号的293T细胞为作用细胞，Huh-7为靶细胞，

图片源自参考资料7。

除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽类药物的另一优势是支持非侵入性鼻腔给药，适合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，检测鼻腔给药下的EK1的体内分布非常重要。基于活体成像技术，研究观察到Cy5荧光标记的EK1可广泛分布于整个呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝脏、肾和脾，都能检测到EK1的分布，表明EK1可以进入血液循环系统和其他脏器中。因此，EK1还可能作用于由冠状病毒导致的系统性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表现出QL的抗病毒能力，有效YZ了因感染带来的体重减轻和死亡现象。从体外到体内的多方面安全性评价表明通过鼻腔给药的EK1是低免疫原性，安全的ZL策略。因此，EK1是一个新型、有潜力的广谱抗冠状病毒 药物，值得进一步的深入研究。

上：基于活体成像检测鼻腔给药下Cy5标记的EK1在小鼠体内的分布；小动物活体成像检测基于IVIS平台。下：EK1处理对模型鼠死亡率、体重和病毒滴度的影响，图片源自参考资料7。

总结

通过上述四个案例，我们总体介绍了靶向病毒段的大分子疗法的研究流程和关注点。助力此类ZL方法的研发，珀金埃尔默提供成熟的整体应用解决方案。针对携带萤火虫报告基因的假病毒研究，我们提供全面、配套的涵盖化学发光试剂，微孔板和高通量检测平台的解决方案。对于基于慢病毒包装系统的假病毒，我们还可以提供p24检测解决方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平台的解决方案，我们还可以分析短程和长程的复杂亚细胞活动，例如由病毒介导的膜融合过程。在血清和抗体的筛查和分析中，强大的高内涵解决方案能Z大程 度发挥表型筛选的优势，发现具有中和能力、安全的潜在抗体。同时，ADCC，作为关键的抗感染抗体工作机制之一，也是我们的主要应用关注点。针对ADCC的检测，我们提供金标准、灵活的放射和非放射解决方案，助力抗体类药物的深入评价^[8]。Z后，在临床前动物研究中，除了中和检测外，我们提供覆盖功能到结构的活体成像解决方案，助力病理检测、药物分析和药效评价等核心工作。

参考文献

1. 药物机制解读 | “人民的希望”抗病毒 药物瑞德西韦(Remdesivir)https://mp.weixin.qq.com/s/MyJO1XjkD6uQAgsoMFTxEw

2. Wang L, et al. Evaluation of candidate vaccine approaches for MERS-CoV. Nat Commun. 2015 Jul 28;6:7712.

3. Luke T, et al. Human polyclonal immunoglobulin G from transchromosomic bovines inhibits MERS-CoV in vivo. Sci Transl Med. 2016 Feb 17;8（326）:326ra21.

4. Thomas Luke, et al. Fully Human Immunoglobulin G From Transchromosomic Bovines Treats Nonhuman Primates Infected With Ebola Virus Makona Isolate. J Infect Dis. 2018 Dec 15; 218（Suppl 5）: S636–S648.

5. Ying T, et al. Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody. Nat Commun. 2015 Sep 15;6:8223.

6. Fei Yu,et al. A potent germline-like human monoclonal antibody targets a pH-sensitive epitope on H7N9 influenza hemagglutinin. Cell Host Microbe. 2017 Oct 11; 22（4）: 471–483.e5.

7. Shuai Xia,et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv. 2019 Apr; 5（4）: eaav4580

8. DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞ZL——AD0116细胞杀伤ZT之ADCChttps://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ

       由武汉东湖国家自主创新示范区生物医药行业协会主办，北京中航环宇国际交流ZX承办，2019ZG武汉光谷生物学术年会暨生物制药质量分析技术论坛，于2019年12月19-20日在武汉纽宾凯光谷国际酒店胜利召开。

        ProteinSimple作为知名的生物制药仪器和技术提供商，参加了本次盛会。

1. 会议分享

       ZG科学院院士，ZG科学院大连化学物理研究所研究员，张玉奎院士在大会上介绍了基于蛋白质组学的jing准医学的新技术和新方法。

       ZG食品药品检定研究院，生物制品检定所，重组药物室的饶春明主任，在大会上介绍了生物技术药物质量控制的检定方法的建立及验证，以及新版药典三部标准提高的研究。

       湖北省药品监督检验研究院院长，姜红院长在大会上做了报告，报告内容涵盖了对疫苗管理法的解读，批签发制度的介绍，以及新技术的应用实例的分享。

ProteinSimple在大会上分享了生物大分子药物表征的创新技术，内容包含：

1. 电荷异质性：iCIEF（全柱成像毛细管等电聚焦电泳法，2020版药典收录）

2. 大小异质性：CE-SDS（2020版药典修订）

3. 大小异质性鉴别：Jess CE-SDS免疫学检测技术

4. SDS-PAGE成像：FluorChem系列符合 21 CFR Part 11成像系统

5. 工艺相关杂质：Ella-Cygnus第三代HCP全自动快速ELISA技术

6. 颗粒物形态：MFI微流体成像颗粒表征技术

2. ProteinSimple大会部分PPT分享

3. 会议交流

（来源：ProteinSimple）

       近年来随着以治 疗性蛋白、肽、核酸及疫苗等生物药的广泛应用，对此类生物大分子的分离、解析、评价技术水平也提出了更高的要求。生物大分子的分离手段多种多样，例如：盐析、有机溶剂沉淀法、液相色谱法、电泳等方法。其中，高效液相色谱法在分辨率、选择性、分离速度方面具有明显优势。液相色谱法不仅适用于天然产物，还广泛应用于重组蛋白和合成核酸的研发、抗体药物生产中的纯化及质量管理等。

       在这本《生物分离读本》中，我们对分析这些生物大分子样品时所采用的液相色谱分离模式的原理、特点及实际应用案例进行了详细介绍。希望对您的分析工作有所帮助。

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