微生物菌体浓度的测定方法有哪些

bdmyfb 2016-09-15 00:41:02 1307 浏览

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yinghao岁月 2016-09-16 00:00:00

一般采取两种方法来测定菌液浓度。一为活菌计数法，此法能准确地判断菌液浓度，但有明显的滞后性，无法在diyi时间内󰀁确定其实际浓度，待结果出来后，再开始检测，菌的活性将有所下降，给实验室操作带来诸多不便;二为比浊法，此法能快速地判断菌液浓度，但为粗略的估计值，受限于各人肉眼的观察，误差较大，准确性不高。󰀁󰀁

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★フレンズ★ 2016-10-17 00:00:00

微生物菌体浓度的测定方法：活菌计数法此法能准确地判断菌液浓度，但有明显的滞后性，无法在diyi时间内2确定其实际浓度，待结果出来后，再开始检测，菌的活性将有所下降，给实验室操作带来诸多不便;比浊法此法能快速地判断菌液浓度，但为粗略的估计值，受限于各人肉眼的观察，误差较大，准确性不高。微生物菌体浓度的测定（纤维制品的KJ性试验方法为例）一、菌种：大肠杆菌(EscherichiacoliATCC8099) 二、试剂与仪器蛋白胨牛肉膏氯化钠Cary100紫外——可见光分光光度计三、培养基营养细菌培养基NB。蛋白胨5g，牛肉膏粉3g，蒸馏水1000mL，pH6.8±0.2。营养琼脂培养基NA。蛋白胨5g，牛肉膏粉3g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH6.8±0.2。1、对数生长期菌液的制备取在规定保存代数之内的供试菌种，在火焰旁，挑取一铂金环，在营养琼脂培养基上划线，于37℃±1℃培养24h后，在平板上挑取饱满的单菌落，置于20mL营养细菌培养基中，振荡(110r/min，振幅3cm)培养24h。2、稳定期菌液的制备取培养好的对数生长期菌液0.4mL，于20mL营养细菌培养基中，再振荡培养4h，即为稳定期菌液。四、吸光度(ABS值)的测定取培养好的稳定期菌液，按不同的设定稀释倍数(5、10、20、40倍)，依次进行稀释，(稀释液为1/20NB)，在660nm标准波长下，测得一组不同菌液浓度的吸光度。(用空白1/20NB进行测试前调零)。五、活菌计数在无菌室内火焰旁进行操作。分别依次测定四个不同稀释倍数的菌落数。每个稀释倍数依次制定几个浓度梯度，用灭菌吸管各吸取1mL注入平皿。注入约15mL，45～50℃的营养琼脂培养基，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转平皿，置37℃±1℃培养箱内培养24h后，进行菌落计数。用肉眼观察，点出菌落数，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。六、标准曲线的制作运用生物统计ORG数据分析软件，以吸光度ABS值为横坐标，稳定期的菌液浓度为纵坐标绘制标准曲线。

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①紫外吸收法

检测原理：

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，进行蛋白质含量的测定。

方法特点：

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。

干扰物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质。

检出限：50~100ug蛋白含量。

适用范围：适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

②微量凯氏定氮法

凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法，可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。

实验原理：

样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

方法特点：

优点：通用性强，测定费用低，易实现，仪器简单且测定结果的重复性和重现性好。

缺点：实验耗时长、灵敏度低。

检出限：0.2~1mg蛋白含量。

适用范围：凯氏定氮法测的是总蛋白的量，一些非蛋白氮无法检测出。

③双缩尿法

实验原理：

双缩尿（NH3CONHCONH3）是两个分子经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱溶液中，双缩尿与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽链，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。

方法特点：

优点：适合检测总蛋白质的含量，操作简单、测量速度快。

缺点：标准物质必须使用代表性很强的样品，需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，故测定工作费力费时。不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。

检出限：测定蛋白质含量测定范围为1-20mg蛋白质。

干扰物：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

适用范围：常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

④Lowry 法

Lowry 法是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是最灵敏的蛋白质测定方法之一，在生物化学领域得到广泛的应用，目前分为基本法和改良简易法，改良简易法可获得与基本法相近的结果。

基本法实验原理：

显色原理与双缩尿法相同，但加入了Folin-酚酞试剂，以增加显色量，从而提高检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：①在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。②Folin一酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

特点：

优点：灵敏度高。

缺点：耗费时间长，操作时间需精-准控制，标准曲线绘制麻烦，专一性较差，干扰物质比较多。

检出限：可检测的最-低蛋白质量达5ug。通常测定范围是20~250ug。

干扰物：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。

适用范围：除蛋白含量测定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

⑤考马斯亮蓝法

实验原理：

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最-大吸收峰的位置（max），由465mm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595mm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

方法特点：

优点：灵敏度比Lowry高约4倍，高效率、检测过程简便、只需要一种试剂，抗干扰能力强。

缺点：测定误差大，不适用于不同蛋白的检测。