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前言

在PCR检测过程中，不可否认的是，没有任何检测是100%准确的，比如我们可能也曾听过假阳性这个名词，那为什么会出现假阳性呢?这其实跟实验操作过程造成的污染相关，在实验开展过程中，主要有4种污染途径：标本间交叉污染、PCR试剂污染、PCR扩增产物污染、实验室克隆质粒污染。

如何对污染进行监测？

1. 阳性对照

在建立PCR实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否符合理论要求的一个重要的参考标志，阳性对照要选择扩增度中等、复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2. 阴性对照

每次PCR试验务必做阴性对照，它包括：①标本对照，被检标本是血清就用鉴定后的正常血清做对照，被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞做对照；②试剂对照，在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。

3. 重复性实验

4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增

如何避免PCR污染？

实验室防污染是重中之重，毕竟影响最终检测结果，那么我们有哪些防污染的方法呢？

除了注意避免人工操作引入的污染，我们在实验时应设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增带的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应由一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。同时减少PCR循环次数，PCR产物达到检测水平就适可而止。

近年来，数字PCR技术凭借高灵敏度和JD定量的优势，在JZ医学领域广受青睐，疫情下对核酸检测的需求更是推动了整个行业的发展，数字PCR时代正在来临

数字PCR技术原理

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子JD定量技术，20 世纪末，由Vogelstein 等提出这一概念。dPCR一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光定量分析。

首先是将含有荧光染料或探针的PCR反应体系分割成几万个均一微液滴，每个微液滴内会含有一个或多个DNA模板，再将这些微液滴分配到单独试管内进行PCR扩增，其中含有DNA模板的微液滴会产生扩增产物。

PCR扩增完成后，依次对每个微液滴进行荧光检测，根据微液滴信号的峰值高度，绘制出微液滴荧光分布的散点图，通过软件将荧光强度数字化，分出具有较强荧光的阳性微液滴（计为“1”）和具有较弱荧光的阴性微液滴（计为“0”），ZH通过“1”和“0”的个数来实现JD定量。

▲数字PCR原理图

微液滴荧光强度的检测 

检测微液滴内荧光强度常用的方法是流式技术，这种技术能够以每秒1000–3000个微液滴的通量高灵敏地检测微液滴内的荧光强度。

典型的流式装置原理是：通过光学装置将侧面的激发光反射并聚焦在微液滴通过的微流道内，当微液滴在微流道的限制下排成单列通过聚焦位置时，每个微液滴内的荧光被依次激发，光电器件采集每个微液滴的荧光数据，ZH进行统计分析。

▲检测微液滴内荧光强度的原理图

凌云自主高灵敏相机

凌云自主高灵敏TB-HS12MM-G相机是一款科学级 sCMOS 相机，具备非常好的灵敏度与宽动态（卷帘模式下读出噪声 <2.0e，动态范围可达85dB）；分辨率4608×2592，高达 1200万像素的解像能力；基于外触发模式下，全局快门曝光模式在曝光时间为30ms 时帧频可达30fps。

同时该相机利用半导体制冷与水冷结合的双制冷模式，使得芯片稳定工作在ZJ的成像温度下，从而获得较高的成像品质，该相机也可提供客户定制化服务，适用于高速荧光探测、基因测序、脑成像等生命科学领域。

▲凌云自主高灵敏TB-HS12MM-G相机

数字PCR应用前景

与传统qPCR技术相比，数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性，尤其在复杂基质及痕量样品检测方面具有独特优势，其为分子生物学、医学、微生物和环境科学等领域的研究提供了全新的技术手段和思路。

采用 dPCR 对早期世代转基因植株外源基因拷贝数及合子性进行鉴定，为转基因优异转化体的创制带来了极大便利，缩短了筛选进程，提高了筛选效率。此外，dPCR 技术为多个专业领域检测限和阈值设定提供了新的度量标尺。对低含量转基因样品的JZ定量检测可为我国转基因产品检测标准的制定及相关法规的出台提供理论与技术支持。

dPCR 技术还可与 NGS、质谱等多种技术相结合，使其在临床诊断、转基因成分分析、基因表达分析、环境微生物分析和NGS测序验证等研究领域也显示出巨大的优势和应用前景。

▲数字PCR应用方向