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  美媚帮手 2009-04-29 00:00:00

  碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 仪器、材料与试剂] （一） 仪器 1、 恒温培养箱 2、 恒温摇床 3、 台式离心机 4、 高压灭菌锅 （二） 材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸（EDTA） 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠（SDS） 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.乙醇 9.盐酸（HCl） 10.Bt菌株 11.吸头、小指管 （三） 试剂 1、 溶液I 50mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris•HCl 10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 2、 溶液II 0.4mol/L NaOH ， 2% SDS ，用前等体积混合 3、 溶液III 5mol/L乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 4、 TE缓冲液 10mmol/L Tris•HCl （一） 提取质粒 1、 将Bt菌株接种于LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。 2、 取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。 5、 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。 6、 加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 7、 12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。 8、 向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 9、 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。 10、50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存 这下边应该全点

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  晓豸 2009-04-29 00:00:00

  碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中， 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。

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  妈他好乖 2009-04-29 00:00:00

  碱裂解法： 此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中， 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。 酚氯仿裂解法 ① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 μg/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1 h）. 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况. 碱解法 操作步骤 1、细菌繁殖 LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜 2、离心10 min，5000 rpm， 4℃；弃上淸液 3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm， 4℃ 加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min 4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min 5、加入1.2 ml Solution II， 冰浴，5 min 6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm， 4℃ 7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min 8、离心10 min，12000 rpm， 4℃ 9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中 10、加入40 ul，3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、离心10 min，12000 rpm， 4℃ 13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。 14、电泳检测提取DNA的质量 还有碱变性法、SDS法、 羟基磷灰石层析法等

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