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中国医药行业标准：YY/T 0606.5-2007

透明质酸钠分子量测定方法

概述

透明质酸钠（HA）是一种天然存在的多糖，由交替重复的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺单元组成(如右图)。这种生物聚合物存在于所有哺乳动物系统中，但主要存在于关节液、玻璃体和各种疏松结缔组织（如鸡冠）中。HA在眼科、医学、药理学,药 用辅料，医美/化妆品等方面具有巨大的商业价值和应用前景。

众多的文献报道了透明质酸/钠（HA）分子量的测定方法，例如柱校正方法（GPC法），粘度法，18角度激光光散射凝胶色谱法（SEC-MALS）。这些科学研究证实了HA的物理化学行为，分子大小，结构信息等均与材料宏观特性密切相关。这些指标涵盖如重均分子量（Mw）及其分布（多分散指数PDI）、尺寸（均方根半径Rg，流体力学半径Rh）、特性粘度h，分子构象等。如何更简单，便捷，高效的测定透明质酸钠的绝 对分子量是科学家面临的主要挑战。因此，早期的研究充分对比了传统凝胶色谱法（柱校正方法），粘度法，18角度激光光散射方法（ASTM D4001：1993），18角度光散射凝胶色谱系统（国际标准ASTM F2602，F2605）。这些研究对象包括了：透明质酸钠，壳聚糖，海藻酸钠等准确度，精密度等。而这些对比充分证明了SEC-MALS技术无需任何假设前提和标准品校正，即可直接测量低，中，高分子量范围的HA样品。具有较高的准确性和精密度，可实现连续测定，可用于HA的质量控制和应用研究。

方法

分析样品：七种不同的HA样品

分析方法：SEC-MALS（在线粘度检测器）

结果

表1总结了七个HA样品的相关理化特性，其结果与理论/文献值一致。

为了评估分子构象信息，对所有样品构建MHS图，以样品HA-2作为代表展示MHS图和其最小二乘回归曲线，见图4。根据该曲线，样本HA-2的K和α值计算为K=0.0277和α=0.817，两个值均接近理论/文献值。然而，这些数字不应简单计算，因为可以看出MHS轨迹显示出明显的曲率。本研究中测试的所有七个HA样品均显示出与图3中所示相似的MHS曲率，因此通过MHS图的直接线性回归确定的K和α系数不能作为整个HA分子量范围内MHS行为的准确表征。

图4 HA-2的Mark–Houwink–Sakurada曲线和线性拟合

通过使用MHS曲线的多项式拟合（在本例中为二阶）并随后取该函数的导数，可以确定瞬时α值：

图5显示了样品HA-2的α值，其范围从低分子量时的1.0到高分子量时的近0.55。其他六个HA样品显示出类似于前面所述的α行为，α值在低分子量时为1.1，在高分子量时为0.5。

α在其摩尔质量范围内的这种变化表明HA在较低分子量下表现出free-draining、non-gaussian chain行为。这种聚电解质固有的刚性迫使分子在较低的分子量下呈现更为延伸的构象，从而相应地具有较高的α值。随着分子量增加，HA缓慢转变为标准Gaussian chain行为，α值下降。这可能有助于解释文献中发表的 HA 的MHS的多样性。

图5 Mark–Houwink–Sakurada图及二阶拟合

Stepan Podzimek等学者在对HA溶液构象进行研究发现天然的HA具有宽广的分子量范围，其构象图（0.49）显示器在溶液中呈现无规线团状态。此外，其均方根半径高达100nm以上。而三角度光散射检测技术仅能满足50nm以下的检测需求，采用18角度激光光散射技术可则以准确测量此类具有宽广分子量分布的样品。

总结

通过SEC-MALS可以直接测定HA的绝 对分子量、分子量分布，特性粘度等可以进一步分析HA的构象变化。该方法具有较高的准确性和精密度，可实现连续测定，可用于HA的质量控制和应用研究。

Reference

AN1302: Characterization of hyaluronic acid with online multi-angle light scattering and differential viscometry.