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壳聚糖及其测定

壳聚糖是目前研究最多的多糖类天然高分子材料，对于生物体来说，壳聚糖具有优良的生物相容性和降解性。将其植入人体后，可被人体组织中的酶缓慢吸收，是用来制作缝线和创伤覆盖材料的优秀高分子材料。由于其优越的性能，使得壳聚糖在化工、 轻工、 医药、 食品及环境保护等领域中的开发应用研究十分活跃。

壳聚糖的学名为β-（1，4）聚-2-氨基-D-葡萄糖，是甲壳素最重要的衍生物,是除蛋白质以外含氮量MAX的有机氮源,也是自然界中仅有的碱性多糖，其相对分子量通常在10万-30万，但几乎不溶于水，其中分子量是影响壳聚糖溶解性的主要因素之一，分子量越低其溶解性就越好。

凝胶色谱法(GPC)是测定壳聚糖相对分子质量及其分布的常用方法，这将有助于推动壳聚糖作为生物医用材料的选择和设计。

应用案例——GPC测定壳聚糖

本案例基于Waters1515凝胶色谱仪，搭配Ultrahydrogel色谱柱，对市售壳聚糖的相对分子量及分布进行计算。

1、仪器

▲Waters1515凝胶色谱仪，配示差检测器

2、标准品

聚乙二醇标准品套组

3、实验条件

01RI流通池温度

40 °C

02流动相

50 mM 的醋酸+100 mM 硝酸钠缓冲液

03流速

0.45 mL/min

04色谱柱

Waters Ultrahydrogel 2000柱，7.8 ×300 mm

05柱温

40 °C

06样品稀释剂

50 mM 的醋酸+100 mM 硝酸钠缓冲液

07进样量

50 μL

08数据处理软件

Empower QS +GPC计算模块色谱数据软件

09样品处理

1 mg/mL的壳聚糖

4、结果与讨论

壳聚糖样品的色谱图如下：

图1. 壳聚糖样品色谱图

利用Empower QS中GPC选项的功能，采用标样的保留时间绘制标准曲线，来计算壳聚糖样品的分子量分布，软件会自动计算出对应的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、多分散性等相关参数。

连续6针进样的重复性色谱图如下，通过计算Mw的RSD小于0.2%，表明此方法重复性良好。

Waters GPC优势

行业先导Waters 从 1963 年起就致力于 GPC 技术的研究和开发，经过 50 多年的发展，使Waters 成长为 GPC 技术的前锋。
专业 多项特有技术加持，保证检测结果的准确性及重现性。
易上手 简单、易操作，性能稳定，专为高聚物领域量身打造。

参考文献

[1] 凝胶渗透色谱法研究壳聚糖生物材料酶降解过程的均匀性

[2] 用GPC研究壳聚糖氧化降解过程中的分子量及其分布_刘羿君

[3] 壳聚糖作为医用高分子综述-王霞

      凡是做过有机检测的实验人员，一提起前处理，无不对其“记忆深刻”—耗时、繁琐、无聊……工作时间的80%耗费在了前处理上，“我好难！”成了他们调侃的常用语。更有不少实验室管理者吐槽：“好不容易招到各方面都满意的人，却因为受不了前处理的繁琐和枯燥离职了，想留住人才太难！”

       其实，实验室只需具备莱伯泰科有机前处理整体解决方案中的这四种仪器，便能轻松应对有机前处理全流程，将实验人员从繁琐的前处理中解脱出来，实验效率高了，心情自然好了，还有更多时间去提升业务水平，实验室管理者再也不用担心人才流失了。 

       莱伯泰科有机前处理整体解决方案囊括了：样品提取、浓缩、净化后再富集的全过程，解决方案可以自动化的对复杂样品进行提取，也可以对含量稀少的样品进行富集，优点如下： 

可自动化连续运行，无人值守，解放实验人员双手 

大幅节省样品前处理时间 

所有样品瓶通用，无需转移，确保实验的回收率 

避免人为操作的误差，易于得到稳定重现的结果

 这四种仪器分别是：

 一、双通道GX萃取：Flex-HPSE全自动GX快速溶剂萃取仪 

      在填充好两个样品之后，即可萃取与填充同时进行，所有样品填充好后，无需实验人员值守，48个样品只需一夜，且收集瓶与平行浓缩仪通用，不用转移样品，只需将整架收集瓶转移至平行浓缩仪即可。 

 二、高通量大体积快速浓缩：MultiVap-10定量平行浓缩仪、M64全自动高通量平行浓缩仪、MVP真空平行浓缩仪       

       莱伯泰科的这三款浓缩仪，可以满足日常检测的绝大部分浓缩需求，可结合实验需求选择配置一台或者多台。 

 三、全自动上样、分离和收集样品：GPC1000全自动凝胶净化系统 

 四、最多可同时运行8通道：SPE1000全自动固相萃取系统    

      如果您的实验室还没有配齐上述四种有机前处理设备，或者您对我们的产品有任何疑问，请马上致电400-070-8778，我们将竭诚为您服务！ 

关于莱伯泰科 

      北京莱伯泰科仪器股份有限公司（股票代码：688056.SH）成立于2002年，公司自成立之初便专注于科学仪器设备的研发，立志为环境检测、食品安全、YL卫生、疾病控制、材料研究等众多基础科学及行业应用提供实用可靠的实验室设备和整体解决方案。公司发展至今已拥有各类ZL及软件著作权100余项，持续通过高新技术企业认证，连续多年被业内媒体评为ZG仪器仪表行业“ZJ影响力企业”。产品服务涵盖实验室分析仪器、样品前处理仪器、实验室设备、YL设备、实验室耗材和实验室工程建设等。目前，公司产品已销往90多个国家，共计服务客户近3万家。如需了解莱伯泰科的详细信息，请访问http://www.labtechgroup.com/。

1、流动相

A、流动相纯度：建议使用色谱纯及以上的级别的流动相（乙酸乙酯：环己烷=1:1或二氯甲烷）。

B、使用前，请务必要按照凝胶净化色谱柱上的标签规格（乙酸乙酯：环己烷=1:1或二氯甲烷）要求配置相应的的流动相，流动相应满足实验过程需求，对于柱体上标有流动相为乙酸乙酯：环己烷=1:1的凝胶色谱柱,流动相只能使用（乙酸乙酯：环己烷=1:1）,尤其是不能使用二氯甲烷作为它的流动相,否则将会对凝胶色谱柱的填料的膨胀系数造成影响,从而使得柱子不能够有效的使用。需要使用0.45微米的滤膜过滤并超声脱气混合均匀。

C、流动相的用量:由于方法中的流速为5mL/min，如果实验样品的数量很多，应该一次性配好流动相充足的量，避免中途在往试剂瓶里添加。否则易产生气泡，导致基线不稳。

2、样品溶剂的选择

在使用GPC时,请注意样品溶剂对凝胶色谱柱的影响, 即，在选择样品溶剂时，应该选择与流动相极性相符的溶剂，尽量使用流动相作为样品溶剂。

3、输液泵压力偏高

如发现控制面板上的输液泵压力变大或报警停泵时，请将仪器的放空滤片座卸下来用流动相超声清洗10~20min后，再安装上使用。

4、在较长时间内不使用GPC凝胶系统时

请您先用对应的流动相将凝胶色谱柱冲洗10～20min，然后取下，用特有的聚四氟堵头将其两端封好，在下次使用时再重新安装上，然后以其所使用的流动相冲洗十分钟以上（使其基线达到平稳）后，在进行使用。

5、GPC管路的清洗

若使用GPC仪器做茶叶等颜色较深的样品时（当回收率降低时），请每隔半个月将凝胶净化色谱柱拆下来，用一个不锈钢两通替代柱子连接管路，然后把流动相换成甲醇：丙酮（1:1），冲洗管路一个小时，然后换回流动相冲洗二十分钟，再把凝胶柱安装上，再做实验。

6、保护柱（预柱）的清洗

当回收率降低时，如有保护柱（预柱）的话，用甲醇：丙酮（1:1），低流速反向冲洗二十分钟。

7、及时倾倒废液

请注意及时处理废液瓶，以避免废液过满而流出所造成的污染。

8、自动液体处理器的维护

请您在使用过程中不要随便移动、变更样品盘上的样品架，因为该位置在安装时已经调整好，移动、变更样品盘上的样品架，将可能会发生进样针折断等事故。在实验结束以后，请尽可能的对其做一些防尘措施，以便延长其使用的寿命。

9、实验结束后的操作

实验结束后，请点击工作站左侧下方的【手动操作】按钮，选择【GPC信息】项，点击【输液泵】中的【停止】按钮，将输液泵关闭后，再关闭工作站，然后分别将仪器及电脑的电源关闭。

体积排阻色谱SEC在样品前处理中，有着独特的作用，今天小编就带您一起探寻一下GPC的原理，以及它在样品前处理中的出色应用，一起来学习吧！

1.定义

体积排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，它又称为空间排阻色谱法（Steric exclusion chromatography）。

2.分类

流动相：水；凝胶过滤色谱（GFC）

流动相：有机相； 凝胶渗透色谱（GPC）

3.固定相

填料：多孔凝胶（软性凝胶和刚性凝胶）；

特点1：表面分布大小不一的小孔（如图）

特点2：凝胶颗粒间存在空隙

4.分离

特点1：

化合物按照分子量大小，分为小分子，中等分子、大分子。

小分子： 能通过小孔、中孔、大孔、空隙；

中等分子：能通过中孔、大孔、空隙；

大分子： 被排阻在外，只能通过填料空隙。

特点2：

分子量越小，越能通过更多不同的孔径的孔，分子量越大，只能通过一些较大孔径的孔，分子量足够大完全被排斥在外，而不能通过孔，只能通过填料间的空隙。

特点3：

能通过的孔越多，所走的距离越长，出峰越慢；能通过的孔越少，所走的距离越短出峰越快。

5.原理

基于分配理论：

6.确定分子量大小

如同色谱质谱的定量分析一样，通过标准曲线法来定量未知样品的分析物质的浓度。在GPC中组分从柱中的洗脱体积（Ve）与分子量（M）存在对应关系lgM- Ve，我们可先通过配置好的已知分子量的化合物分子，进样后，在凝胶柱上存在对应的洗脱体积，来配制标准曲线，在相同色谱条件下，未知的物的分子量，可以通过其洗脱体积，在准曲线上找到对应的分子量。

A: 分子量为10⁶， 对应洗脱体积为V₀

B：分子量为10³ , 对应洗脱体积为V₀+V_P

X: 未知物，对应的洗脱体积为V_x， 可求得其分子量大小

7.两个极限

极限一：排阻极限

如果要分离的物质，分子量足够大，比填料的ZD孔径都大，所有分子都将被排斥。

极限二：渗透极限

如果要分离的物质，分子量足够小，比填料的最小孔径都小，所有分子都被渗透。

结论：体积排阻色谱只能分离凝胶柱处于渗透极限对应化合物分子量A和处于排阻极限对应化合物分子量B之间的物质。

8.举个例子（土壤中的多环芳烃的分离）

图中的蓝色为为土壤萃取物的紫外吸收曲线，可以发现，色谱峰型较宽，只出现一个混杂的色谱峰，如不处理，将难以进行定量分析，黑色线为经过SEC处理的土壤提取物，当得知多环芳烃流出的时间后（收集点），在其流出时间处收集（红色部位），将收集物在反相液相色谱上分析，得到如下色谱图：

经过SEC处理的收集物（多环芳烃），在HPLC上 得到了好的分离，干扰性杂质（玉米油、DEHP等）也得到了很好的去除效果。另外GPC得一个典型的应用，就是在农药残留分析中，去除油脂，大分子蛋白、色素。SEC提供了常规SPE和LLE难以分离处理的复杂基质样品的前处理手段。

普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，由于该多糖独特的结构和性质，在医药、食品、石油、化工等行业具有广泛的应用前景。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。

本应用是将HLC-8420GPC凝胶渗透色谱系统和LenS3多角度光散射检测器联用，采用TSKgel GMPWXL色谱柱对普鲁兰多糖标准品的绝 对分子量、分子量分布及回转半径 (Rg) 进行了表征。

分析条件

仪器:  HLC-8420GPC & LenS3

色谱柱: TSKgel GMPWXL (7.8mmI.D.×30cm, 13μm)

流动相:  0.1 M NaNO3

流速:  1.0 mL/min

样品浓度:  1.095 mg/mL

进样量:  100 μL

温度:  40℃

样品:  普鲁兰多糖

分析结果

图1  多检测器测试谱图

（紫色曲线为示差(RI)检测器信号，红色曲线为10°角光散射(LALS)检测器信号，蓝色曲线为90°角光散射(RALS)检测器信号，绿色曲线为170°角光散射(HALS)检测器信号）

图2 绝 对分子量、回转半径(Rg)及RI随流出时间曲线

（紫色曲线为示差(RI)检测器信号，绿色曲线为绝 对分子量，蓝色为回转半径(Rg)随流出时间曲线）

图3  分子量分布和累积分布曲线

（黄色曲线为分子量分布曲线，紫红色曲线为累积分布曲线）