如何为免疫荧光显微镜制备样本
徕卡显微系统(上海)贸易有限公司-
样本
IF方案存在于多种不同的样本当中。最简单最常用的方法是对细胞培养物中的培养（真核）细胞进行染色。贴壁生长的细胞可以接种在盖玻片上，采用多微孔插入或者直接接种在玻璃底培养皿上并在所需的时间用于IF检查。IF还可在细胞涂抹于载玻片（例如细胞离心涂片）后用于悬浮细胞的检查。在这两种情况下，需ZD分析细胞内的过程或结构，这被称为免疫细胞化学（ICC）。
另一方面，在免疫组织化学（IHC）typo3/当中通过组织特定的环境联系来检查是否存在蛋白质或分子。此处器官制备的超薄切片（通常包埋在石蜡中）用于比较研究健康器官与疾病器官中蛋白质的表达。
除了制备组织切片外，还可以对整个生物体进行IF检查，这一过程被称为“整体IHC”。为此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、鸡或斑马鱼等，或植物模型如拟南芥。在整体IHC中会受到试样尺寸和相关IF试剂透化深度的限制。单独的孵育步骤比培养细胞的染色要长。此外还必须提供带有特殊光学设备的显微镜用于大样本分析。图1 COS7有丝分裂细胞。染色质（青色，mCherry），有丝分裂纺锤体（黄色，EGFP），高尔基体（红色，Atto647N），线粒体（绿色，AF532），肌动蛋白丝（紫色，SiR700）。样片提供：苏黎世大学Jana Döhner和Urs Ziegler。
清洗步骤
在IF程序中应特别注意清洗步骤，因为适当的清洗可以提高IF质量。PBS是一种标准的清洗缓冲液，而PBS++或PBS-T等变体也很普遍。PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推测其具有防止细胞分离的膜稳定作用。对于PBS-T，添加ZZ浓度为0.05%的清洁剂Tween 20，目的是增加抗体的结合特异性。请务必注意小心地涂抹并吸取清洗缓冲液以免细胞从培养容器或盖玻片上脱落。如有足够的时间，请在吸取缓冲液时等待几分钟，以确保清洗缓冲液有效扩散到样本中。IF程序的各个清洗步骤在下面的标准方案中列出。
传统IF反应的各步骤描述如下。本文结尾附有最常用的间接IF与培养细胞的标准程序。
固定
固定是IF程序的DY步。其目的是保持细胞、细胞结构或组织处于其当前状态，并通过化学试剂长期保存。在固定过程中，重要的是细胞结构尽可能保持其原有的构象。不同的固定方法对IF有用，每种试剂对一抗表位有不同的影响。抗体结合位点可能被掩盖或被固定所破坏，这会损害IF染色质量。由于每种抗体以不同的方式与抗原结合依赖于不同的固定化合物，因此有必要尝试几种新抗体的固定方法。
通常，合适的固定剂规格可以在抗体的数据表上找到。理想的固定应能够保存细胞和亚细胞结构，并为良好的抗体结合暴露出抗原。实际上，您必须在两者之间取得平衡。
固定试剂可以大致划分成2组：化学交联剂和有机溶剂。
化学交联剂如通过游离氨基形成的福 尔 马 林 交联蛋白；细胞形态在大多数情况下保存良好。但抗原也可能发生交联，进而可能减少抗体结合。戊二醛对细胞结构也有保存固定作用，但会导致显微镜下观察到样本有很强的自发荧光（见‘对照’章节）。
有机溶剂如甲醇或丙酮等具有脱氢作用并沉淀蛋白质，从而将其固定在细胞环境中。但切记，在该过程中可溶性分子和许多脂质成分都会丢失。通常将甲醇和丙酮组合使用，因为尽管甲醇最适合保存细胞结构，但它对许多表位有极其不利的影响，而丙酮却破坏性较小。除此还应该考虑到已经存在于细胞中的荧光蛋白（如GFP），会因被有机溶剂固定而在很大程度上被破坏。如果一抗的制造商未建议使用何种固定剂，则用4%福 尔 马 林 在室温下处理10分钟即可用于各种细胞系和抗原。表1：固定试剂透化
通过透化处理，抗体可以进入细胞内结构，否则抗体就无法通过细胞的脂膜。根据固定类型，有时需要单独的透化处理。当用有机溶剂固定时，细胞膜已经具有渗透性，您可以直接进入封闭步骤。用化学交联剂固定的细胞需要用清洁剂进行额外处理以实现透化。使用Triton X-100或NP-40等传统清洁剂，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黄皂甙。同样，根据应用的物质、浓度和培养时间会得到不同的结果，因此实验人员应该在开始时尝试不同的参数。典型的步骤是在室温下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分钟。
如果希望通过IF来分析脂质相关蛋白或膜蛋白，则应谨慎开展透化步骤（=脂质去除）。比较理想的选择是皂甙，能选择性去除质膜上的胆固醇，使细胞内的膜基本上完好无损。如果在抗体染色前忽略了透化处理（只能通过化学交联剂固定），则可以专门标记细胞外质膜结合抗原，以便将其与胞内抗原分开来。核酸染料如DAPI或Hoechst（见‘细胞核染色和样本封固’章节）具有膜渗透性，因此不需要透化处理。
封闭
封闭是在细胞内ZD限度降低一抗非特异性结合的重要步骤。为了实现这一点，可以使用来自牛血清白蛋白（BSA）、奶粉或血清的蛋白质。关键在于，这些封闭蛋白质并不源于产生一抗的物种，否则二抗对于一抗的特异性就会损失。如果您使用的是二抗，如山羊产生的抗小鼠一抗，则理想的封闭试剂是正常的山羊血清。通常使用浓度为1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封闭溶液，并在清洗缓冲液中稀释。在室温下孵育30-60分钟。
免疫反应
经固定、透化和封闭制备样本后，会开始进行免疫反应。样本现在与特定的一抗一起孵育，以标记所需的靶结构。几种一抗可同时应用于样本。如上所述，在间接多色IF中，几种一抗必须来源于不同的物种。首先根据制造商的要求，在选定的封闭溶液中进行抗体稀释。如果对染色不满意，或者如果制造商没有提供任何有关有效稀释的信息，您应该尝试使浓度保持在1:50到1:1000之间。根据抗体的亲和力，孵育时间可能会有所不同。默认培育时间为室温下1-2小时；也可以在4℃下过夜。
如果选择直接IF，则可在一抗孵育后直接进行封片，因为一抗已经带有荧光色素。在间接IF当中，二抗现在已经对一抗进行了荧光标记。这里的关键点在于使用一抗进行孵育后要进行充分清洗，以减少二抗的非特异性结合。二抗也可以在封闭溶液或清洗缓冲液中进行稀释。如果制造商没有不同的指示，可以从1:200的稀释开始，在室温下孵育1小时。有必要避光培养以防出现荧光色素漂白。
细胞核染色与样本封片
免疫反应之后通常是用DNA染料对细胞核染色。另一方面，在用显微镜观察时这种处理可以更好地在细胞或组织切片内进行定向，同时还可以指示出细胞状态（如有丝分裂）是否为研究所需的状态。即便在没有透化的情况下也能进入到细胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。有鉴于此，实验人员应当十分小心，避免这些染料直接与皮肤接触！室温下简单的细胞染色耗时大约10分钟，期间Hoechst或DAPI需在PBS中稀释。
完成IF步骤后，样本必须适当封片以便于开展显微镜检查。有鉴于此，需要使用封固介质（如Mowiol或Prolong Gold）来将样本固定在显微镜载玻片上并防止样本脱水。另外，封固介质增加了折射率，有利于使用油浸物镜进行显微镜检查。一些制造商提供了带有添加剂的封固介质，如DABCO，这是一种防止样本光漂白的防褪色剂。根据使用的荧光色素，一些抗褪色剂比其他的更有效。
此外，还可使用添加了DNA染料的封固介质以便在包埋期间对细胞核进行染色，就无需进行单独的细胞核染色。如果使用硬化封固介质（通常情况下），则允许样本过夜固化，因此可以在第二天进行显微镜检查。以这种方式生产的玻片几乎可以长时间储存在室温或4℃的黑暗环境中，但请记住，荧光色素的荧光强度会随着时间的推移而减弱。图2 斑马鱼胚胎。用STELLARIS 8获得3D图像，细胞核：蓝色，Hoechst；内皮细胞：绿色，EGFP；细胞膜：紫色，NIR750。样本由法国斯特拉斯堡的IGBMC的Julien Vermot提供。
对照
免疫荧光必须进行适当对照，以正确显示显微镜图像。缺少或不适合的对照通常会导致假阳性结论和不正确的数据。首先应当分析只被固定、透化和封闭的样本以便了解细胞间室的自发荧光typo3/。有时即使没有进行IF染色，结构也可能出现强荧光信号。
为了进一步的对照和调整间接IF的显微镜参数，使用已采用上述方法进行处理过的样本，但样本还要额外使用二抗进行孵育。首先将揭示二抗与样本的强非特异性结合。其次，设置显微镜参数以便在该对照的图像采集期间不记录任何信号。此设置用作后续采集的阈值来排除二抗的假阳性信号。在直接IF当中，自体荧光对照用于调节阈值。接下来分析与特异性一抗一起孵育的样本，如果是间接IF，也分析与二抗一起孵育的样本。此时应可检测到荧光信号，其高于自发荧光和二抗的阴性对照。
为了确保一抗特异性标记所需结构，一些制造商为一抗提供遮蔽特定抗原的肽封闭，从而防止抗体与其表位结合。如此处理成本高昂，但也是确定抗体特异性的ZJ方法，因此得到可靠的结果。
在多色IF实验中还必须注意所选荧光色素之间的串扰。如果是第 一次进行多色IF检查，建议在单独的制备中另外染色靶向结构，并将这些图像与多色图像进行比较。ZH应该仔细查看所获得的数据并将其与您的期望和一抗的现有数据进行比较。表2：哪些对照测试哪些内容
局限性
如前所述，IF检查有诸多优势，但同样也存在着一定的劣势。关键点是样本的固定：固定意味着灭活，因此活细胞成像已变得不再可能。因此对动态过程的分析会比较复杂，每个时间点上的细胞都必须予以固定和染色。所以快速动态过程无法通过IF来进行观察。这显然是融合蛋白表达荧光标记如GFP（绿色荧光蛋白）的优势，比较适合用于活细胞成像。
如上所述，IF实验过程中（固定/透化）会改变细胞结构，因此伪影可解释为假阳性信号。所以有必要为每个IF染色准备适当的对照品，可能很费时。另一个缺点同样不可避免：荧光染料的光漂白。像GFP这样的荧光蛋白也受此影响，但当储存在适当的条件下，即使在几个月的永 久性制备后，GFP也能被检测到。相反，IF荧光色素的强度损失更快，这反映在显微镜下样本的快速漂白。即使是用抗褪色剂封固介质也只能暂时起作用。图4：整套程序的流程图
标准IF流程
IF实验所需时间：约5个小时。
这是一种盖玻片上通过化学交联剂进行固定的培育细胞接受间接IF检查的标准方案。
· 湿盒非常适合IF实验，并且可以轻松完成自制（见幻灯片“如何制备湿盒”）。该处理可防止试剂干燥并允许在黑暗中进行培养，这对于处理荧光色素很重要，并且对于已经存在的荧光蛋白是必要的。
· 试剂用量的选择要确保盖玻片能够完全湿润。确保样本JD不会完全干燥。
· 所有培育步骤都在室温下完成。
1. 清洗细胞两次并使用镊子小心地将带有向上翻转细胞的盖玻片放入湿盒。
2. 使用4% 福 尔 马 林 进行10分钟的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS进行15-20分钟的透化处理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS进行45分钟的封闭（无需清洗）。
5. 在封闭溶液内稀释一抗并使用2小时（或在4℃下连夜使用）。清洗4次将未结合的一抗彻底清除掉。
6. 使用二抗进行1个小时的孵育，在封闭溶液或清洗缓冲液内进行稀释。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS当中孵育10分钟。彻底清洗4次，即便此时还没有出现细胞核染色。
8. 用镊子轻轻取出盖玻片并将其进入H2O内，清除掉清洗缓冲液的残留盐分。
9. 在显微镜载玻片上滴一滴封固溶液并将盖玻片与细胞倒置这滴溶液上。用镊子轻轻按压试样，使封固介质均匀分布而不会挤压样本。
10.固化后就准备好进行显微镜观察了。配方
清洗缓冲液
· 1 × PBS（磷酸盐生理盐水缓冲液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4· 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4
· 如为PBS++，需添加ZZ浓度为1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如为PBS-T，需添加ZZ浓度为0.05%的Tween 20
固定缓冲液
· 福 尔 马 林：
1. 将4% PFA（多聚甲醛）溶解于温暖（50-70℃）的dH2O当中，pH值8（使用NaOH进行调节）。
2. 将10 × PBS添加到ZZ浓度为1 × PBS的溶液当中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4。
· 甲醇（预先冷冻至-20℃）：
1. 100%甲醇（-20℃）· 甲醇/丙酮（预先冷冻至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）透化缓冲液· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，ZZ浓度0.1% TX-100· 皂甙：
1. PBS，ZZ浓度0.1%的皂甙
· 其他清洁剂可在PBS当中以相同浓度进行使用。封闭缓冲液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，ZZ浓度为1% BSA· 奶粉：
1. PBS，ZZ浓度为1%奶粉· 正常血清：
1. PBS，ZZ浓度为5%正常血清细胞核染料
· Hoechst或DAPI：在PBS中制备Hoechst 33342或DAPI溶液，ZZ工作浓度为1 μg/mL。
了解更多：https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/?nlc=20201230-SFDC-011237
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- 如何为免疫荧光显微镜制备样本
- 样本
IF方案存在于多种不同的样本当中。最简单最常用的方法是对细胞培养物中的培养（真核）细胞进行染色。贴壁生长的细胞可以接种在盖玻片上，采用多微孔插入或者直接接种在玻璃底培养皿上并在所需的时间用于IF检查。IF还可在细胞涂抹于载玻片（例如细胞离心涂片）后用于悬浮细胞的检查。在这两种情况下，需ZD分析细胞内的过程或结构，这被称为免疫细胞化学（ICC）。
另一方面，在免疫组织化学（IHC）typo3/当中通过组织特定的环境联系来检查是否存在蛋白质或分子。此处器官制备的超薄切片（通常包埋在石蜡中）用于比较研究健康器官与疾病器官中蛋白质的表达。
除了制备组织切片外，还可以对整个生物体进行IF检查，这一过程被称为“整体IHC”。为此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、鸡或斑马鱼等，或植物模型如拟南芥。在整体IHC中会受到试样尺寸和相关IF试剂透化深度的限制。单独的孵育步骤比培养细胞的染色要长。此外还必须提供带有特殊光学设备的显微镜用于大样本分析。图1 COS7有丝分裂细胞。染色质（青色，mCherry），有丝分裂纺锤体（黄色，EGFP），高尔基体（红色，Atto647N），线粒体（绿色，AF532），肌动蛋白丝（紫色，SiR700）。样片提供：苏黎世大学Jana Döhner和Urs Ziegler。
清洗步骤
在IF程序中应特别注意清洗步骤，因为适当的清洗可以提高IF质量。PBS是一种标准的清洗缓冲液，而PBS++或PBS-T等变体也很普遍。PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推测其具有防止细胞分离的膜稳定作用。对于PBS-T，添加ZZ浓度为0.05%的清洁剂Tween 20，目的是增加抗体的结合特异性。请务必注意小心地涂抹并吸取清洗缓冲液以免细胞从培养容器或盖玻片上脱落。如有足够的时间，请在吸取缓冲液时等待几分钟，以确保清洗缓冲液有效扩散到样本中。IF程序的各个清洗步骤在下面的标准方案中列出。
传统IF反应的各步骤描述如下。本文结尾附有最常用的间接IF与培养细胞的标准程序。
固定
固定是IF程序的DY步。其目的是保持细胞、细胞结构或组织处于其当前状态，并通过化学试剂长期保存。在固定过程中，重要的是细胞结构尽可能保持其原有的构象。不同的固定方法对IF有用，每种试剂对一抗表位有不同的影响。抗体结合位点可能被掩盖或被固定所破坏，这会损害IF染色质量。由于每种抗体以不同的方式与抗原结合依赖于不同的固定化合物，因此有必要尝试几种新抗体的固定方法。
通常，合适的固定剂规格可以在抗体的数据表上找到。理想的固定应能够保存细胞和亚细胞结构，并为良好的抗体结合暴露出抗原。实际上，您必须在两者之间取得平衡。
固定试剂可以大致划分成2组：化学交联剂和有机溶剂。
化学交联剂如通过游离氨基形成的福 尔 马 林 交联蛋白；细胞形态在大多数情况下保存良好。但抗原也可能发生交联，进而可能减少抗体结合。戊二醛对细胞结构也有保存固定作用，但会导致显微镜下观察到样本有很强的自发荧光（见‘对照’章节）。
有机溶剂如甲醇或丙酮等具有脱氢作用并沉淀蛋白质，从而将其固定在细胞环境中。但切记，在该过程中可溶性分子和许多脂质成分都会丢失。通常将甲醇和丙酮组合使用，因为尽管甲醇最适合保存细胞结构，但它对许多表位有极其不利的影响，而丙酮却破坏性较小。除此还应该考虑到已经存在于细胞中的荧光蛋白（如GFP），会因被有机溶剂固定而在很大程度上被破坏。如果一抗的制造商未建议使用何种固定剂，则用4%福 尔 马 林 在室温下处理10分钟即可用于各种细胞系和抗原。表1：固定试剂透化
通过透化处理，抗体可以进入细胞内结构，否则抗体就无法通过细胞的脂膜。根据固定类型，有时需要单独的透化处理。当用有机溶剂固定时，细胞膜已经具有渗透性，您可以直接进入封闭步骤。用化学交联剂固定的细胞需要用清洁剂进行额外处理以实现透化。使用Triton X-100或NP-40等传统清洁剂，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黄皂甙。同样，根据应用的物质、浓度和培养时间会得到不同的结果，因此实验人员应该在开始时尝试不同的参数。典型的步骤是在室温下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分钟。
如果希望通过IF来分析脂质相关蛋白或膜蛋白，则应谨慎开展透化步骤（=脂质去除）。比较理想的选择是皂甙，能选择性去除质膜上的胆固醇，使细胞内的膜基本上完好无损。如果在抗体染色前忽略了透化处理（只能通过化学交联剂固定），则可以专门标记细胞外质膜结合抗原，以便将其与胞内抗原分开来。核酸染料如DAPI或Hoechst（见‘细胞核染色和样本封固’章节）具有膜渗透性，因此不需要透化处理。
封闭
封闭是在细胞内ZD限度降低一抗非特异性结合的重要步骤。为了实现这一点，可以使用来自牛血清白蛋白（BSA）、奶粉或血清的蛋白质。关键在于，这些封闭蛋白质并不源于产生一抗的物种，否则二抗对于一抗的特异性就会损失。如果您使用的是二抗，如山羊产生的抗小鼠一抗，则理想的封闭试剂是正常的山羊血清。通常使用浓度为1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封闭溶液，并在清洗缓冲液中稀释。在室温下孵育30-60分钟。
免疫反应
经固定、透化和封闭制备样本后，会开始进行免疫反应。样本现在与特定的一抗一起孵育，以标记所需的靶结构。几种一抗可同时应用于样本。如上所述，在间接多色IF中，几种一抗必须来源于不同的物种。首先根据制造商的要求，在选定的封闭溶液中进行抗体稀释。如果对染色不满意，或者如果制造商没有提供任何有关有效稀释的信息，您应该尝试使浓度保持在1:50到1:1000之间。根据抗体的亲和力，孵育时间可能会有所不同。默认培育时间为室温下1-2小时；也可以在4℃下过夜。
如果选择直接IF，则可在一抗孵育后直接进行封片，因为一抗已经带有荧光色素。在间接IF当中，二抗现在已经对一抗进行了荧光标记。这里的关键点在于使用一抗进行孵育后要进行充分清洗，以减少二抗的非特异性结合。二抗也可以在封闭溶液或清洗缓冲液中进行稀释。如果制造商没有不同的指示，可以从1:200的稀释开始，在室温下孵育1小时。有必要避光培养以防出现荧光色素漂白。
细胞核染色与样本封片
免疫反应之后通常是用DNA染料对细胞核染色。另一方面，在用显微镜观察时这种处理可以更好地在细胞或组织切片内进行定向，同时还可以指示出细胞状态（如有丝分裂）是否为研究所需的状态。即便在没有透化的情况下也能进入到细胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。有鉴于此，实验人员应当十分小心，避免这些染料直接与皮肤接触！室温下简单的细胞染色耗时大约10分钟，期间Hoechst或DAPI需在PBS中稀释。
完成IF步骤后，样本必须适当封片以便于开展显微镜检查。有鉴于此，需要使用封固介质（如Mowiol或Prolong Gold）来将样本固定在显微镜载玻片上并防止样本脱水。另外，封固介质增加了折射率，有利于使用油浸物镜进行显微镜检查。一些制造商提供了带有添加剂的封固介质，如DABCO，这是一种防止样本光漂白的防褪色剂。根据使用的荧光色素，一些抗褪色剂比其他的更有效。
此外，还可使用添加了DNA染料的封固介质以便在包埋期间对细胞核进行染色，就无需进行单独的细胞核染色。如果使用硬化封固介质（通常情况下），则允许样本过夜固化，因此可以在第二天进行显微镜检查。以这种方式生产的玻片几乎可以长时间储存在室温或4℃的黑暗环境中，但请记住，荧光色素的荧光强度会随着时间的推移而减弱。图2 斑马鱼胚胎。用STELLARIS 8获得3D图像，细胞核：蓝色，Hoechst；内皮细胞：绿色，EGFP；细胞膜：紫色，NIR750。样本由法国斯特拉斯堡的IGBMC的Julien Vermot提供。
对照
免疫荧光必须进行适当对照，以正确显示显微镜图像。缺少或不适合的对照通常会导致假阳性结论和不正确的数据。首先应当分析只被固定、透化和封闭的样本以便了解细胞间室的自发荧光typo3/。有时即使没有进行IF染色，结构也可能出现强荧光信号。
为了进一步的对照和调整间接IF的显微镜参数，使用已采用上述方法进行处理过的样本，但样本还要额外使用二抗进行孵育。首先将揭示二抗与样本的强非特异性结合。其次，设置显微镜参数以便在该对照的图像采集期间不记录任何信号。此设置用作后续采集的阈值来排除二抗的假阳性信号。在直接IF当中，自体荧光对照用于调节阈值。接下来分析与特异性一抗一起孵育的样本，如果是间接IF，也分析与二抗一起孵育的样本。此时应可检测到荧光信号，其高于自发荧光和二抗的阴性对照。
为了确保一抗特异性标记所需结构，一些制造商为一抗提供遮蔽特定抗原的肽封闭，从而防止抗体与其表位结合。如此处理成本高昂，但也是确定抗体特异性的ZJ方法，因此得到可靠的结果。
在多色IF实验中还必须注意所选荧光色素之间的串扰。如果是第 一次进行多色IF检查，建议在单独的制备中另外染色靶向结构，并将这些图像与多色图像进行比较。ZH应该仔细查看所获得的数据并将其与您的期望和一抗的现有数据进行比较。表2：哪些对照测试哪些内容
局限性
如前所述，IF检查有诸多优势，但同样也存在着一定的劣势。关键点是样本的固定：固定意味着灭活，因此活细胞成像已变得不再可能。因此对动态过程的分析会比较复杂，每个时间点上的细胞都必须予以固定和染色。所以快速动态过程无法通过IF来进行观察。这显然是融合蛋白表达荧光标记如GFP（绿色荧光蛋白）的优势，比较适合用于活细胞成像。
如上所述，IF实验过程中（固定/透化）会改变细胞结构，因此伪影可解释为假阳性信号。所以有必要为每个IF染色准备适当的对照品，可能很费时。另一个缺点同样不可避免：荧光染料的光漂白。像GFP这样的荧光蛋白也受此影响，但当储存在适当的条件下，即使在几个月的永 久性制备后，GFP也能被检测到。相反，IF荧光色素的强度损失更快，这反映在显微镜下样本的快速漂白。即使是用抗褪色剂封固介质也只能暂时起作用。图4：整套程序的流程图
标准IF流程
IF实验所需时间：约5个小时。
这是一种盖玻片上通过化学交联剂进行固定的培育细胞接受间接IF检查的标准方案。
· 湿盒非常适合IF实验，并且可以轻松完成自制（见幻灯片“如何制备湿盒”）。该处理可防止试剂干燥并允许在黑暗中进行培养，这对于处理荧光色素很重要，并且对于已经存在的荧光蛋白是必要的。
· 试剂用量的选择要确保盖玻片能够完全湿润。确保样本JD不会完全干燥。
· 所有培育步骤都在室温下完成。
1. 清洗细胞两次并使用镊子小心地将带有向上翻转细胞的盖玻片放入湿盒。
2. 使用4% 福 尔 马 林 进行10分钟的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS进行15-20分钟的透化处理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS进行45分钟的封闭（无需清洗）。
5. 在封闭溶液内稀释一抗并使用2小时（或在4℃下连夜使用）。清洗4次将未结合的一抗彻底清除掉。
6. 使用二抗进行1个小时的孵育，在封闭溶液或清洗缓冲液内进行稀释。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS当中孵育10分钟。彻底清洗4次，即便此时还没有出现细胞核染色。
8. 用镊子轻轻取出盖玻片并将其进入H2O内，清除掉清洗缓冲液的残留盐分。
9. 在显微镜载玻片上滴一滴封固溶液并将盖玻片与细胞倒置这滴溶液上。用镊子轻轻按压试样，使封固介质均匀分布而不会挤压样本。
10.固化后就准备好进行显微镜观察了。配方
清洗缓冲液
· 1 × PBS（磷酸盐生理盐水缓冲液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4· 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4
· 如为PBS++，需添加ZZ浓度为1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如为PBS-T，需添加ZZ浓度为0.05%的Tween 20
固定缓冲液
· 福 尔 马 林：
1. 将4% PFA（多聚甲醛）溶解于温暖（50-70℃）的dH2O当中，pH值8（使用NaOH进行调节）。
2. 将10 × PBS添加到ZZ浓度为1 × PBS的溶液当中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4。
· 甲醇（预先冷冻至-20℃）：
1. 100%甲醇（-20℃）· 甲醇/丙酮（预先冷冻至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）透化缓冲液· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，ZZ浓度0.1% TX-100· 皂甙：
1. PBS，ZZ浓度0.1%的皂甙
· 其他清洁剂可在PBS当中以相同浓度进行使用。封闭缓冲液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，ZZ浓度为1% BSA· 奶粉：
1. PBS，ZZ浓度为1%奶粉· 正常血清：
1. PBS，ZZ浓度为5%正常血清细胞核染料
· Hoechst或DAPI：在PBS中制备Hoechst 33342或DAPI溶液，ZZ工作浓度为1 μg/mL。
了解更多：https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/?nlc=20201230-SFDC-011237
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- CCD 显微镜摄像 MC20-N
自从美国科学家威拉德.博伊尔和乔治.史密斯于1969年发明了半导体集成电路成像技术,CCD 感应器。 CCD 数码成像对摄影产生了革命性的影响。在感光胶片之外，人们可以通过电子电路捕捉图像，这些以数字形式存在的图像更加易于处理和分发。数字图像已经成为许多研究领域中不可替代的重要工具。
数码成像技术应用到显微镜上，以替代以往的胶卷拍摄，现在已经广泛应用了。以前我们用胶卷来进行显微拍摄，要等一卷拍完，冲洗出来才能确定拍摄的图像是否清晰，如果拍摄的图像不理想，而显微观察的样品又失效了，就需要重新制作样品，给研究工作带来很大的不便，而现在使用显微镜摄像头来拍摄显微图像，所见即所得，当时就是保存处理，甚至统计分析，极大的提高了工作效率。
显微镜摄像头的组成
显微镜摄像头包括CCD / CMOS专业相机，图像采集处理软件，显微镜接口，数据传输线等，其中Z核心的设备是 CCD 和 CMOS 图像传感器，前者由光电耦合器件构成，后者由金属氧化物器件构成。两者都是光电二极管结构感受入射光并转换为电信号，主要区别在于读出信号所用的方法。
CCD (Charge Coupled Device ，感光耦合组件)上感光组件的表面具有储存电荷的能力，并以矩阵的方式排列。当其表面感受到光线时，会将电荷反应在组件上，整个 CCD 上的所有感光组件所产生的信号，就构成了一个完整的画面。 CCD 的结构分三层 ，diyi层“微型镜头”“ON-CHIP MICRO LENS”，这是为了有效提升 CCD 的总像素，又要确保单一像素持续缩小以维持 CCD 的标准面积，在每一感光二极管上(单一像素)装置微小镜片。 CCD 的第二层是“分色滤色片”，目前有两种分色方式，一是RGB原色分色法，另一个则是CMYG补色分色法。原色 CCD 的优势在于画质锐利，色彩真实，但缺点则是噪声问题。第三层：感光层，这层主要是负责将穿过滤色层的光源转换成电子信号，并将信号传送到影像处理芯片，将影像还原。
数码成像的核心器件除 CCD ,现在越来越多的使用 CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor，互补性氧化金属半导体， CMOS 和 CCD 一样同在数码相机中可记录光线变化的半导体。 CMOS 传感器中每一个感光元件都直接整合了放大器和模数转换逻辑，当感光二极管接受光照、产生模拟的电信号之后，电信号首先被该感光元件中的放大器放大，然后直接转换成对应的数字信号。 CMOS 的优势在于成本低，耗电需求少，便于制造， 可以与影像处理电路同处于一个芯片上，缺点是较容易出现杂点。
显微镜摄像头相关参数
对 CCD / CMOS 数码成像系统的结构和原理有了一个基本了解后，我们再对成像系统的一些基本参数作一个说明。在实际应用中，很多用户对像素多少很敏感，一上来就提到我要多少万像素的成像系统，其实在专业成像应用中，像素多少只是影响成像的一个因素，还有其他很多指标，包括分辨率，感光器件大小，动态范围,灵敏度，量子效率，信噪比等。
感光器件的面积大小是衡量显微镜摄像头质量的一个重要指标，感光器件的面积越大，捕获的光子越多，感光性能越好，信噪比越低。当前数码成像系统中较常应用的感光器件规格如下：1英寸（靶面尺寸为宽12.7mm*高9.6mm，对角线16mm），2/3英寸， 1/2英寸，1/3英寸，另外有时也用到1/1.8英寸,1/2.5英寸的 CCD / CMOS 感光器件。
像素是 CCD / CMOS 能分辨的Z小的感光元件，显微镜摄像头的像素由低到高有：45万左右，140万左右，200万左右，300万左右，500万左右，900万像素，甚至还有更高的达到2000万像素以上。一般来说，像素越高，图像分辨率越高，成像也就越清晰，但有时候图像分辨率达到一定程度后，就不是影响成像质量的主要指标了。比如图像分辨率高，噪声也很高时，成像质量也不会很好。暗电流是导致 CCD 噪音的很重要的因素。暗电流指在没有曝光的情况下，在一定的时间内， CCD 传感器中像素产生的电荷。我们在做荧光拍摄的时候，需要的曝光的时候比较长，这样导致 CCD 产生较多的暗电流，对图像的质量影响非常大。通常情况下通过降低 CCD 的温度来Z大限度的减少暗电流对成像的影响。Peltier制冷技术一般可将 CCD 温度降低5-30°C，在长时间拍摄或一次曝光超过5-10秒， CCD 芯片会发热，没有致冷设备的芯片，“热”或者白的像素点就会遮盖图像，图像会出向明显的雪花点。 CCD 结构设计、数字化的方法等都会影响噪音的产生。当然通过改善结构、优化方法，同样能减少噪音的产生。显微荧光或其他弱光的拍摄对 CCD 噪音的降低要求很高，应选用高分辨率数字冷却 CCD 成像系统，使其能够捕获到信号极其微弱的荧光样品图像，并且能够Z大程度的降低噪音，减少背景，提供出色的图像清晰度。所以一般在荧光及弱光观察时需要选择制冷 CCD 。
在显微数码成像过程中，对于荧光及弱光的拍摄，除了制冷降低热噪声外，还可使用 BINNING技术提高图像的灵敏度，BINNING像素合并是一种非常有用的功能，它可被用来提高像素的大小和灵敏度，比如摄像头像素大小为5u,当经过2x2合并后，像素大小为10u，3X3合并后，像素大小为15u, 这是图像的整体像素变少了，但成像的灵敏度可提高9倍。
动态范围表示在一个图像中Z亮与Z暗的比值。12bit表示从Z暗到Z亮等分为212＝4096个级别，16bit即分为216个级别，可见bit值越高能分出的细微差别越大，一般 CMOS 成像系统动态范围具有8-10bit, CCD 以10-12bit为主，少部分可达16bit。对动态范围进行量化需要一个运算公式，即动态范围值 = 20 log (well depth/read noise)，动态范围的值越高成像系统的性能就越好。
量子效率也称像素灵敏度，指在一定的曝光量下,像素势阱中所积累的电荷数与入射到像素表面上的光子数之比。不同结构的 CCD 其量子效率差异很大。比如100光子中积累到像素势阱中的电荷数是50个，则量子效率为50％（100 photons = 50 electrons means 50% efficiency）。值得注意的是 CCD 的量子效率与入射光的波长有关。
对显微镜摄像头的参数有了整体认识后，在实际应用中选择合适型号的产品就比较容易了。高分辨率显微数码成像技术在国外已有二十来年的发展历史，产品目前已比较成熟。国外的专业数码产品有多个品牌，比较的有德国的ProgRes，美国Roper Scientific的系列产品，另外OLYMPUS、NIKON、LEICA、ZEISS等显微镜厂家也有一些配套的专业数码成像系统 。其中 CCD 成像系统主要采用SONY及KODRA公司的芯片，因此相关产品性能差别不是很大。
国内专业数码成像产品的设计制造时间还不长，但随着配套技术的成熟，100万像素以上的 CCD / CMOS 专业数码成像产品开始陆续推出，主要的专业厂家有北京的大恒、微视、杭州欧普林，广州明美等企业。北京大恒早期主要研发生产图像采集卡，目前可以量产140万像素的 CCD 摄像头，130万/200万/320万/500万像素 CMOS 摄像头，主要用到工业领域。广州明美是国内少数专业从事显微数码成像产品研发与销售的高新技术企业，由于具有雄厚的显微镜技术背景，明美推出的130万-900万系列 CMOS 专业成像系统，1/2\ 2/3 寸140万像素、300万像素的 CCD 显微镜摄像头，都专门针对显微成像的特点,对底层驱动软件进行了修正，使之显微成像操作更方便，色彩还原更真实，清晰度更高。
显微镜摄像头一般都是在电脑上预览与保存，因此需要配套的相应的图像采集及处理软件，这方面国内由于知识产权保护等原因，很多公司对软件的开发重视程度不够，认为硬件开发出来就万事大吉了，结果很多国产的成像系统的控制调节不方便，功能有限，需要专业的操作人员才能得到好的图象，影响了市场的普及推广，不过Z近两年这种情况有了明显的改进，明美光电，欧普林科技等公司都推出了配套的功能丰富的软件系统。
2009年中，明美在国内SJ推出了采用SONY芯片的500万像素冷 CCD 显微镜摄像头MC50，其相关技术指标达到了国际知名的Roper Scientific公司MP5.0的标准，实际拍摄效果与进口产品相比也毫不逊色，操作人性化方面则更胜一筹，Z重要的是，MC50的价格只有国外同类产品的一半左右，这样会大大推动高端显微镜摄像头的应用与普及，真正打破了国外厂家在专业高端数码成像领域的垄断。
（来源：广州市明美光电技术有限公司 ）
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倒置荧光显微镜下的免疫荧光细胞：探索微观世界的奥秘
显微镜观察免疫荧光细胞是一种重要的实验方法，用于研究细胞内蛋白质、核酸等成分的表达、功能和相互作用，目前，免疫荧光显微镜已经成为生物学研究中不可或缺的工具之一。
在倒置荧光显微镜观察细胞时，需要选择合适的显微镜参数，以确保观察的准确性和稳定性。例如，光源的种类、显微镜的分辨率、物镜放大倍数和荧光通过率等因素。此外，在进行免疫荧光显微镜观察细胞时，需要选择合适的荧光强度和荧光颜色，以避免对观察结果的干扰。
倒置荧光显微镜MF52-N采用无限远光学设计和数显LED荧光模块，光路经过深度优化，能提供简单易用的荧光激发和高质量的相衬、荧光和明场成像，可选双光路、一体供电、人走灯灭，广泛用于细胞培养、生物制药、医疗检测等领域。
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- 工业应用的显微镜照明 | 如何为显微分析选择合适的光源
本文旨在为使用显微镜检测的用户提供实用的建议，帮助他们为零件或组件观察选择最 佳照明或照明系统。显微镜使用的照明会严重影响到最 终的图像质量，并且会对可视化细节造成显著影响。以下信息可以帮助用户选择可针对显微分析需求优化成像结果的照明。
显微镜检测需要什么样的照明？
工业制造和生产、流程工艺、质量控制和保证（QC/QA）、故障分析（FA）或研发（R&D）的零部件检查通常需要借助显微镜完成。所用显微镜的性能对于检测效率有着巨大影响。
如何选择有助于帮助使用显微镜检测的用户获取最 佳图像结果的照明，取决于此类零部件的类型以及必须显示的感兴趣细节[1-4]。
本文可以为需要使用显微镜检测的用户提供实用的建议，帮助他们为零件或组件观察选择最佳照明或照明系统。以下信息可以帮助用户选择适合显微分析的照明。
什么类型的显微镜光源
最合适显微分析？
10 到 20 多年前，卤素灯[5]是显微镜检测最常用的照明类型。不过，也是从那时候起，LED（发光二极管）灯[6、7]越来越多用于显微镜照明。
LED 照明的优点
相比卤素灯，LED 显微镜照明技术可以为显微镜成像提供多项优点。具体包括：
更长的使用寿命（25,000 到 50,000 小时）
更低的功耗
色温自然
即使在低亮度状况下也能保持恒定色温
更低的发热（作为冷光源，用于对温度敏感的样品）
更为实用且紧凑的设计
为什么显微镜照明
在显微分析过程中极为重要？
如果需要选择合适的照明类型以便对部件或零件进行高质量的显微观察和成像，需要考虑哪些关键因素：
待观察的样品类型（组件、零件等）；
需要分析的样品特征（发光或透明区域、孔洞、划痕、表面结构等）；
当前采用的照明类型很难用于某些特定应用（显微分析、FA、R&D 等）；
在显微镜观察过程中需要接触样品，例如，使用镊子、烙铁或其他需要在样品和物镜之间保持足够工作距离的工具[8、9]。
使用显微镜进行检测的用户可以必须尝试多种照明类型才能找到最 佳照明[10、11]。
选择合适的 LED 显微镜照明
LED 照明解决方案描述如下。包括 LED3000 和 LED 5000 系统，主要用于立体[9]或数码显微镜[12]，通常用于进行显微分析。需要用到它们的其他应用示例包括故障分析（FA）和研发（R&D）。LED3000 和 LED 5000 照明系统的一些基本信息如表 1 所示。
LED3000 和 LED 5000 显微镜照明解决方案概述
环形灯（RL）提供明亮且均匀的照明；适用于多种类型的零部件。此外，扩散器和偏振光组可用于两种环形灯类型。这些配件可以减少眩光和斑点突出的问题。
同轴照明（CXI），其中的光束经引导通过光学器件，在零部件上发生反射，最适合光滑和反射组件。如果必须评估细微裂纹或表面质量，这种光源尤其有用。
近垂直照明（NVI）通过非常靠近光轴放置的 LED 灯实现。它能提供几乎没有阴影的照明，适用于有凹槽和深孔的零部件，或者需要长工作距离的零部件。
采用灵活鹅颈设计的聚光灯照明（SLI）提供适合多种类型零部件的高对比度照明。
漫射和高度漫射照明（DI 和 HDI）专为反光、非平面或弯曲的零部件设计。由于背反射光的数量，这些情况很难成像。
多重对比照明，利用来自两个不同方向和角度的照明实现可重复对比，对于很难找到细节的零部件特别有用。
背光照明（BLI）可以为具有透明区域的零部件提供透射照明。
徕卡 LED 5000 和 LED3000 的照明效果
不同样品的示例图如下所示。这些图像由配备 Flexacam C3 显微镜相机和 LED3000 或LED 5000 照明系统的徕卡立体显微镜（M60 或 M125）记录。所用照明类型为环形灯（RL）[带漫射器或偏振器]、近垂直（NVI）、同轴（CXI）、聚光灯（SLI）、多重对比（MCI）和漫射（DI）或高度漫射（HDI）照明。
参考样品：硬 币
图 1 显示了使用各种 LED 照明获得的金属硬 币图像。硬 币图像清晰展示出不同对比度带来的差异。
图 1a：环形灯（RL），所有区段
图 1b：环形灯（RL），所有左半区段
图 1c：环形灯（RL），左上象限区段
图 1d：近垂直照明（NVI）
图 1e：同轴照明（CXI）
图 1f：高度漫射照明（HDI）
图 1g：多重对比照明（MCI）
图 1h：聚光灯照明（SLII），双灯印刷电路板（PCB）
印刷电路板（PCB）
图 2 显示了使用 RL、NVI 和 SLI 照明记录的印刷电路板图像。
图 2a：环形灯（RL），配漫射器：多样品特征
图 2b：近垂直照明（NVI）：孔洞和凹槽
图 2c：环形灯（RL），配交叉偏振器：反光区域
图 2d：聚光灯照明（SLI）：多样品特征晶圆加工
晶圆加工
图 3 显示了使用 RL、NVI、CXI 和 SLI 照明记录的晶圆加工图像。
图 3a：环形灯（RL），配漫射器：多样品特征
图 3b：同轴照明（CXI）：晶圆加工的表面纹理
图 3c：近垂直照明（NVI）：晶圆加工的孔洞和凹槽
图 3d：聚光灯照明（SLI）：多样品特征汽车零部件
汽车零部件
图 4 显示了使用 RL、NVI 和 SLI 照明记录的链轮图像。
图 4a：环形灯（RL），配漫射器：多样品特征
图 4b：近垂直照明（NVI）：孔洞和凹槽
图 4c：环形灯（RL），配交叉偏振器：反光区域
图 4d：聚光灯照明（SLI）：多样品特征医疗器械
医疗器械
图 5 显示了使用 RL、NVI 或 SLI 照明记录的髋关节植入物图像。
图 5a：环形灯（RL），配漫射器：多样品特征
图 5b：近垂直照明（NVI）：孔洞和凹槽
图 5c：环形灯（RL），配交叉偏振器：反光区域
图 5d：聚光灯照明（SLI）：多样品特征
显微镜检测时 LED 照明选择指南
下方表 2 显示了 LED3000 和 LED 5000 系列照明解决方案的快速选择指南。LED3000 系列专为常规应用（例如纤维分析和质量控制）设计，而 LED 5000 系列更适合高级应用（例如故障分析和研发）。本指南可以帮助显微镜用户，为特定组件或零件的显微分析寻找最为合适的照明系统。
图 6：LED3000/LED 5000 快速选择指南
其他推荐
除了集成到徕卡显微镜的高质量光学器件，在选择照明系统时，必须确定要分析的组件细节和观察所需的视场（物场）。还值得考虑显微镜计算机编码的优势和显微镜光学性能，例如物镜在传输、色差校正和平面偏差方面的优势，即平面复消色差、消色差等。
结 论
有时，很难找到适合检测零部件的显微镜照明系列。然而，此处提到的意见和建议可以帮助用户了解各种照明解决方案，从而找到能够为图像观察和记录提供最 佳结果的解决方案。
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- 冬季如何为爱车选择防冻液？
汽车防冻液在冬天起到防冻作用，防止冷却液结冰而导致胀裂散热器，冻坏发动机；在夏天防冻液起到冷却的作用，能够带走发动机的多余热量控制金属部件的温度，防止发动机开锅。但是防冻液冰点的检测方法是怎样的呢？如何为爱车选择防冻液呢？下面小编就带大家来了解一下:
测试冷冻冰点要用测试仪来完成测试。冰点测定仪操作方法为：掀起盖板用柔软绒布交盖板及棱镜表面擦拭干净；将待测液体用吸管滴于棱镜表面，合上盖板轻轻按压，将折射计对向明亮处，旋转目镜使视场内刻度线清晰，读出明暗分界线在标示板上相应标尺上的数值即可；测试完毕，用绒布擦净棱镜表面和盖板，清洗管，将仪器放还于包装盒内。
要检测防冻液的质量好坏，最直接的方法就是检测防冻液的冰点和沸点，一般普通防冻液的冰点z低可达-40℃，而优质防冻液一般能达到-60℃左右。水的沸点是100℃，而防冻液至少应达到 110℃以上。防冻液的冰点越低，沸点越高，温差越大，则说明品质就越好。反之，温差越小，防冻液的品质就相对差一些。
防冻性能测试。冰点测试是对防冻液能否在寒冷天气里使用的一种防冻性能测试。可采用防冻液冰点测试仪，用比重原理来指示冰点的高低，应用方便。
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