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前言
上期我们进行了免疫荧光原理、实验步骤的探讨，本期我们一起走进免疫荧光常见问题的分析，帮助大家解决在实验过程中遇到的一些问题，让大家都能成为免疫荧光小能手。
常见问题
1背景荧光高
① 洗涤不足——充分洗涤，适当增加洗涤次数和时间；
② 样本干燥——在湿盒中孵育抗体，避免干燥；
③ 抗体浓度过高——预实验测定浓度；
④ 样本自发荧光——染色前先行检测自发荧光情况；
⑤ 封闭不充分——延长封闭时间或更换封闭液；
⑥ 二抗非特异性结合——做一组只加二抗孵育的作为对照；
⑦ 抗体孵育时间过长——严格控制孵育时间，适当减少孵育时间；
⑧ 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)——有时切片脱蜡至修复会过夜，第二天加抗体进行染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长；
⑨ 荧光背景噪音大——更换荧光显微镜，使用能够降低背景荧光干扰的显微镜。
2荧光信号弱
① 荧光通道的激发波长和发射波长与染料不匹配——确保使用的显微镜的荧光通道与染料荧光基团的波长相匹配；
② 一抗或二抗不兼容——注意种属是否正确；
③ 一抗不好用——阳性对照确认抗体有效性；
④ 固定过度或不充分——适当调整固定时间；
⑤ 样本保存不当导致荧光淬灭——注意保存过程中的湿度和避光；
⑥ 一抗变质或质量差的多克隆抗体——注意抗体有效期，与新买抗体或用过的抗体作比较；
⑦ 信号弱或无信号——可裂解细胞后，用WB验证目标蛋白在细胞中是否表达；
⑧ 显微镜收集荧光和成像的能力差——选择一款相机配置好、荧光收集能力强、成像效果好的荧光显微镜。
3细胞/组织形态被破坏
① 组织从玻片上脱落或有气泡——适当增加固定时间，封片时注意不要产生气泡；
② 细胞或组织固定不充分，自发裂解——使用交联性固定剂，适当增加固定时间；
③ 组织切片撕裂或有褶皱——切片过程导致的问题，考虑重新进行切片。
4定位不对
可使用带明场通道的荧光显微镜进行共定位，如下图：
① 细胞核干扰——细胞核位置前面的细胞质染色干扰造成，可以降低抗体浓度或孵育时间；
② 细胞或者组织状态不对——细胞或者组织状态不同导致目的蛋白细胞定位不同，造成最后的定位不对，可重新培养细胞调整好状态或者重新取材，进行再次染色；
③ 核定位不对——可将封闭和打孔合为一步，即在封闭液中添加0.5% TRITON-100，37℃封闭2h，加一抗后4℃孵育过夜(16h)；
④ 不确定观察到的是不是需要的染色位置——使用带明场通道的荧光显微镜，进行荧光定位，确定观察到的染色位置是否正确。
对照实验设置
1内源性组织背景对照
某些含有固有的生物化学性质的组织或细胞，会产生背景或自发荧光，对结果产生影响。以下图为例，DAPI染核，FITC染边界和中间的晶状结构，而TRITC染整个组织背景的颜色，但绿色也产生了背景荧光，对三通道叠加造成了干扰。
2阴性对照
使用确定不含有待测抗原的细胞或组织，与待测样本统一处理，同一观察，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性。
3阳性对照
与阴性对照相反，用确定含有待测抗原的细胞或组织，与待测样本统一处理，同一观察，结果若为阳性，可证明待测抗原具有活性且实验过程没有问题，方法操作可靠。
免疫荧光高清成像
在精心完成免疫荧光后，选择一款操作简单、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。
Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：
☑ 正倒置一体快速切换——切片、细胞观察随心切换，无惧任何耗材；
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☑ 多通道荧光自动拍摄叠加功能——可自动进行多通道成像的叠加，个性化选择查看/保存各通道的组合图像。
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- 如何为免疫荧光显微镜制备样本
- 样本
IF方案存在于多种不同的样本当中。最简单最常用的方法是对细胞培养物中的培养（真核）细胞进行染色。贴壁生长的细胞可以接种在盖玻片上，采用多微孔插入或者直接接种在玻璃底培养皿上并在所需的时间用于IF检查。IF还可在细胞涂抹于载玻片（例如细胞离心涂片）后用于悬浮细胞的检查。在这两种情况下，需ZD分析细胞内的过程或结构，这被称为免疫细胞化学（ICC）。
另一方面，在免疫组织化学（IHC）typo3/当中通过组织特定的环境联系来检查是否存在蛋白质或分子。此处器官制备的超薄切片（通常包埋在石蜡中）用于比较研究健康器官与疾病器官中蛋白质的表达。
除了制备组织切片外，还可以对整个生物体进行IF检查，这一过程被称为“整体IHC”。为此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、鸡或斑马鱼等，或植物模型如拟南芥。在整体IHC中会受到试样尺寸和相关IF试剂透化深度的限制。单独的孵育步骤比培养细胞的染色要长。此外还必须提供带有特殊光学设备的显微镜用于大样本分析。图1 COS7有丝分裂细胞。染色质（青色，mCherry），有丝分裂纺锤体（黄色，EGFP），高尔基体（红色，Atto647N），线粒体（绿色，AF532），肌动蛋白丝（紫色，SiR700）。样片提供：苏黎世大学Jana Döhner和Urs Ziegler。
清洗步骤
在IF程序中应特别注意清洗步骤，因为适当的清洗可以提高IF质量。PBS是一种标准的清洗缓冲液，而PBS++或PBS-T等变体也很普遍。PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推测其具有防止细胞分离的膜稳定作用。对于PBS-T，添加ZZ浓度为0.05%的清洁剂Tween 20，目的是增加抗体的结合特异性。请务必注意小心地涂抹并吸取清洗缓冲液以免细胞从培养容器或盖玻片上脱落。如有足够的时间，请在吸取缓冲液时等待几分钟，以确保清洗缓冲液有效扩散到样本中。IF程序的各个清洗步骤在下面的标准方案中列出。
传统IF反应的各步骤描述如下。本文结尾附有最常用的间接IF与培养细胞的标准程序。
固定
固定是IF程序的DY步。其目的是保持细胞、细胞结构或组织处于其当前状态，并通过化学试剂长期保存。在固定过程中，重要的是细胞结构尽可能保持其原有的构象。不同的固定方法对IF有用，每种试剂对一抗表位有不同的影响。抗体结合位点可能被掩盖或被固定所破坏，这会损害IF染色质量。由于每种抗体以不同的方式与抗原结合依赖于不同的固定化合物，因此有必要尝试几种新抗体的固定方法。
通常，合适的固定剂规格可以在抗体的数据表上找到。理想的固定应能够保存细胞和亚细胞结构，并为良好的抗体结合暴露出抗原。实际上，您必须在两者之间取得平衡。
固定试剂可以大致划分成2组：化学交联剂和有机溶剂。
化学交联剂如通过游离氨基形成的福 尔 马 林 交联蛋白；细胞形态在大多数情况下保存良好。但抗原也可能发生交联，进而可能减少抗体结合。戊二醛对细胞结构也有保存固定作用，但会导致显微镜下观察到样本有很强的自发荧光（见‘对照’章节）。
有机溶剂如甲醇或丙酮等具有脱氢作用并沉淀蛋白质，从而将其固定在细胞环境中。但切记，在该过程中可溶性分子和许多脂质成分都会丢失。通常将甲醇和丙酮组合使用，因为尽管甲醇最适合保存细胞结构，但它对许多表位有极其不利的影响，而丙酮却破坏性较小。除此还应该考虑到已经存在于细胞中的荧光蛋白（如GFP），会因被有机溶剂固定而在很大程度上被破坏。如果一抗的制造商未建议使用何种固定剂，则用4%福 尔 马 林 在室温下处理10分钟即可用于各种细胞系和抗原。表1：固定试剂透化
通过透化处理，抗体可以进入细胞内结构，否则抗体就无法通过细胞的脂膜。根据固定类型，有时需要单独的透化处理。当用有机溶剂固定时，细胞膜已经具有渗透性，您可以直接进入封闭步骤。用化学交联剂固定的细胞需要用清洁剂进行额外处理以实现透化。使用Triton X-100或NP-40等传统清洁剂，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黄皂甙。同样，根据应用的物质、浓度和培养时间会得到不同的结果，因此实验人员应该在开始时尝试不同的参数。典型的步骤是在室温下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分钟。
如果希望通过IF来分析脂质相关蛋白或膜蛋白，则应谨慎开展透化步骤（=脂质去除）。比较理想的选择是皂甙，能选择性去除质膜上的胆固醇，使细胞内的膜基本上完好无损。如果在抗体染色前忽略了透化处理（只能通过化学交联剂固定），则可以专门标记细胞外质膜结合抗原，以便将其与胞内抗原分开来。核酸染料如DAPI或Hoechst（见‘细胞核染色和样本封固’章节）具有膜渗透性，因此不需要透化处理。
封闭
封闭是在细胞内ZD限度降低一抗非特异性结合的重要步骤。为了实现这一点，可以使用来自牛血清白蛋白（BSA）、奶粉或血清的蛋白质。关键在于，这些封闭蛋白质并不源于产生一抗的物种，否则二抗对于一抗的特异性就会损失。如果您使用的是二抗，如山羊产生的抗小鼠一抗，则理想的封闭试剂是正常的山羊血清。通常使用浓度为1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封闭溶液，并在清洗缓冲液中稀释。在室温下孵育30-60分钟。
免疫反应
经固定、透化和封闭制备样本后，会开始进行免疫反应。样本现在与特定的一抗一起孵育，以标记所需的靶结构。几种一抗可同时应用于样本。如上所述，在间接多色IF中，几种一抗必须来源于不同的物种。首先根据制造商的要求，在选定的封闭溶液中进行抗体稀释。如果对染色不满意，或者如果制造商没有提供任何有关有效稀释的信息，您应该尝试使浓度保持在1:50到1:1000之间。根据抗体的亲和力，孵育时间可能会有所不同。默认培育时间为室温下1-2小时；也可以在4℃下过夜。
如果选择直接IF，则可在一抗孵育后直接进行封片，因为一抗已经带有荧光色素。在间接IF当中，二抗现在已经对一抗进行了荧光标记。这里的关键点在于使用一抗进行孵育后要进行充分清洗，以减少二抗的非特异性结合。二抗也可以在封闭溶液或清洗缓冲液中进行稀释。如果制造商没有不同的指示，可以从1:200的稀释开始，在室温下孵育1小时。有必要避光培养以防出现荧光色素漂白。
细胞核染色与样本封片
免疫反应之后通常是用DNA染料对细胞核染色。另一方面，在用显微镜观察时这种处理可以更好地在细胞或组织切片内进行定向，同时还可以指示出细胞状态（如有丝分裂）是否为研究所需的状态。即便在没有透化的情况下也能进入到细胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。有鉴于此，实验人员应当十分小心，避免这些染料直接与皮肤接触！室温下简单的细胞染色耗时大约10分钟，期间Hoechst或DAPI需在PBS中稀释。
完成IF步骤后，样本必须适当封片以便于开展显微镜检查。有鉴于此，需要使用封固介质（如Mowiol或Prolong Gold）来将样本固定在显微镜载玻片上并防止样本脱水。另外，封固介质增加了折射率，有利于使用油浸物镜进行显微镜检查。一些制造商提供了带有添加剂的封固介质，如DABCO，这是一种防止样本光漂白的防褪色剂。根据使用的荧光色素，一些抗褪色剂比其他的更有效。
此外，还可使用添加了DNA染料的封固介质以便在包埋期间对细胞核进行染色，就无需进行单独的细胞核染色。如果使用硬化封固介质（通常情况下），则允许样本过夜固化，因此可以在第二天进行显微镜检查。以这种方式生产的玻片几乎可以长时间储存在室温或4℃的黑暗环境中，但请记住，荧光色素的荧光强度会随着时间的推移而减弱。图2 斑马鱼胚胎。用STELLARIS 8获得3D图像，细胞核：蓝色，Hoechst；内皮细胞：绿色，EGFP；细胞膜：紫色，NIR750。样本由法国斯特拉斯堡的IGBMC的Julien Vermot提供。
对照
免疫荧光必须进行适当对照，以正确显示显微镜图像。缺少或不适合的对照通常会导致假阳性结论和不正确的数据。首先应当分析只被固定、透化和封闭的样本以便了解细胞间室的自发荧光typo3/。有时即使没有进行IF染色，结构也可能出现强荧光信号。
为了进一步的对照和调整间接IF的显微镜参数，使用已采用上述方法进行处理过的样本，但样本还要额外使用二抗进行孵育。首先将揭示二抗与样本的强非特异性结合。其次，设置显微镜参数以便在该对照的图像采集期间不记录任何信号。此设置用作后续采集的阈值来排除二抗的假阳性信号。在直接IF当中，自体荧光对照用于调节阈值。接下来分析与特异性一抗一起孵育的样本，如果是间接IF，也分析与二抗一起孵育的样本。此时应可检测到荧光信号，其高于自发荧光和二抗的阴性对照。
为了确保一抗特异性标记所需结构，一些制造商为一抗提供遮蔽特定抗原的肽封闭，从而防止抗体与其表位结合。如此处理成本高昂，但也是确定抗体特异性的ZJ方法，因此得到可靠的结果。
在多色IF实验中还必须注意所选荧光色素之间的串扰。如果是第 一次进行多色IF检查，建议在单独的制备中另外染色靶向结构，并将这些图像与多色图像进行比较。ZH应该仔细查看所获得的数据并将其与您的期望和一抗的现有数据进行比较。表2：哪些对照测试哪些内容
局限性
如前所述，IF检查有诸多优势，但同样也存在着一定的劣势。关键点是样本的固定：固定意味着灭活，因此活细胞成像已变得不再可能。因此对动态过程的分析会比较复杂，每个时间点上的细胞都必须予以固定和染色。所以快速动态过程无法通过IF来进行观察。这显然是融合蛋白表达荧光标记如GFP（绿色荧光蛋白）的优势，比较适合用于活细胞成像。
如上所述，IF实验过程中（固定/透化）会改变细胞结构，因此伪影可解释为假阳性信号。所以有必要为每个IF染色准备适当的对照品，可能很费时。另一个缺点同样不可避免：荧光染料的光漂白。像GFP这样的荧光蛋白也受此影响，但当储存在适当的条件下，即使在几个月的永 久性制备后，GFP也能被检测到。相反，IF荧光色素的强度损失更快，这反映在显微镜下样本的快速漂白。即使是用抗褪色剂封固介质也只能暂时起作用。图4：整套程序的流程图
标准IF流程
IF实验所需时间：约5个小时。
这是一种盖玻片上通过化学交联剂进行固定的培育细胞接受间接IF检查的标准方案。
· 湿盒非常适合IF实验，并且可以轻松完成自制（见幻灯片“如何制备湿盒”）。该处理可防止试剂干燥并允许在黑暗中进行培养，这对于处理荧光色素很重要，并且对于已经存在的荧光蛋白是必要的。
· 试剂用量的选择要确保盖玻片能够完全湿润。确保样本JD不会完全干燥。
· 所有培育步骤都在室温下完成。
1. 清洗细胞两次并使用镊子小心地将带有向上翻转细胞的盖玻片放入湿盒。
2. 使用4% 福 尔 马 林 进行10分钟的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS进行15-20分钟的透化处理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS进行45分钟的封闭（无需清洗）。
5. 在封闭溶液内稀释一抗并使用2小时（或在4℃下连夜使用）。清洗4次将未结合的一抗彻底清除掉。
6. 使用二抗进行1个小时的孵育，在封闭溶液或清洗缓冲液内进行稀释。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS当中孵育10分钟。彻底清洗4次，即便此时还没有出现细胞核染色。
8. 用镊子轻轻取出盖玻片并将其进入H2O内，清除掉清洗缓冲液的残留盐分。
9. 在显微镜载玻片上滴一滴封固溶液并将盖玻片与细胞倒置这滴溶液上。用镊子轻轻按压试样，使封固介质均匀分布而不会挤压样本。
10.固化后就准备好进行显微镜观察了。配方
清洗缓冲液
· 1 × PBS（磷酸盐生理盐水缓冲液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4· 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4
· 如为PBS++，需添加ZZ浓度为1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如为PBS-T，需添加ZZ浓度为0.05%的Tween 20
固定缓冲液
· 福 尔 马 林：
1. 将4% PFA（多聚甲醛）溶解于温暖（50-70℃）的dH2O当中，pH值8（使用NaOH进行调节）。
2. 将10 × PBS添加到ZZ浓度为1 × PBS的溶液当中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI将pH值调节到7.2-7.4。
· 甲醇（预先冷冻至-20℃）：
1. 100%甲醇（-20℃）· 甲醇/丙酮（预先冷冻至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）透化缓冲液· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，ZZ浓度0.1% TX-100· 皂甙：
1. PBS，ZZ浓度0.1%的皂甙
· 其他清洁剂可在PBS当中以相同浓度进行使用。封闭缓冲液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，ZZ浓度为1% BSA· 奶粉：
1. PBS，ZZ浓度为1%奶粉· 正常血清：
1. PBS，ZZ浓度为5%正常血清细胞核染料
· Hoechst或DAPI：在PBS中制备Hoechst 33342或DAPI溶液，ZZ工作浓度为1 μg/mL。
了解更多：https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/?nlc=20201230-SFDC-011237
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