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- ouyangting8829 2017-03-17 00:00:00
- 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽. 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）. 3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞. 4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞. 5、加入12ml新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟. 6、加9ml用冰预冷的溶液III，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀. 7、4℃下5000g离心15分钟. 8、取上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml)，37℃水浴20分钟. 9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟. 10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟. 11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000)，冰上放置60分钟. 12、4℃下12000g离心15分钟，沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟. 13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中. [注意] 1.提取过程中应尽量保持低温. 2.加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡. 3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时)，使DNA酶失活.
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