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- mengxuntianya 2007-04-06 00:00:00
- 本质上是填料(固定相)的不同，正相色谱柱填料极性强，洗脱顺序由弱到强；反相色谱柱填料极性弱，洗脱顺序由强到弱。以下是详细说明： 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份Z先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分Z先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
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- egmwwbpsh 2018-04-18 11:12:12
- 色谱柱的安装： 1、首先应确认柱和仪器的接头以及管路是否匹配。为减少死体积，进样阀、柱子、检测器之间的连接管路内径尽可能使用内径较小的管线，同时控制进样器、色谱柱和检测器之间连接管线的长度。安装色谱柱之前，确认流路系统中的溶剂是否正常。对分析较复杂的样品建议安装保护柱。 2、为了使色谱柱与仪器系统达Z佳的连接效果，应尽量使用与色谱柱接口相匹配的螺帽和锥形接头，如原来的接头长期匹配其他类型的色谱柱，建议在连接新色谱柱前应检查匹配情况，避免造成色谱柱的损坏或因色谱柱不匹配造成的漏液。 3、使用PEEK 材料的通用接头，只需用手拧紧不需要特定扳手，使用压力为5000psi；使用温度不得超过100℃。 流动相平衡： 1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。 2、流动相使用前需用微孔滤膜过滤，消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5％的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。还可以使色谱柱更容易平衡）。 3、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。如果测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。避免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。 样品制备与操作： 1、样品应当尽可能溶解在能与流动相相互溶的溶剂中。除特殊指明外，如使用强溶剂溶解样品柱子的分辨率将可能降低。 2、样品溶液在进样前应使用针头式过滤器对样品预先过滤。频繁改变流动相组成，会加速降低柱效。 3、色谱柱由高压匀浆法装填，能承受较高压力。为获得Z佳分离效果，使用时请不要超过200kgf，而且避免压力突然上升或变化，否则会造成硅胶填料的破坏，减少色谱柱的使用寿命。除特殊要求外Z高操作温度不要超过60℃。 保存色谱柱： 1、如果流动相含有酸或无机盐，应当先用去离子水（20倍柱体积）冲洗干净。然后用用100％乙腈或甲醇保存色谱柱。Z后用柱子的接头密封，并放在稳定的环境中存放。 2、应避免色谱柱受到直接的机械冲击或摔落，避免造成色谱柱性能的降低。 色谱柱的再生： 1、用相当于20倍柱体积的溶剂按下列顺序冲洗柱子，建议按柱子的箭头方向冲洗，尽可能不反冲：冲洗时使用的的参考溶剂顺序是水、甲醇、氯仿、异丙醇、甲醇。
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色谱法是一种分离混合物中各组分的分析技术。色谱柱是色谱中使用的仪器的一部分。使用柱的五种色谱方法是气相色谱（GC），液相色谱（LC），离子交换色谱（IEC），尺寸排阻色谱（SEC）和手性色谱。色谱的基本原理可以应用于所有五种方法，今天我们分享其中两种方法——气相色谱柱和GX液相色谱柱。
气相色谱柱
在气相色谱中，流动相是气体。气相色谱柱的长度通常在1至100米之间。气相色谱法（GC）：液相固定相结合或吸附到毛细管柱的表面上，或结合到柱内填充的固体载体上。匹配分析物和固定相的极性两者具有相似的极性，固定相的厚度在0.1到8 µm之间，而厚度越厚，分析物的挥发性就越大。
液相色谱柱
GX液相色谱（HPLC）是液相色谱的一种。液相色谱柱共有三种基本类型：液-液，液-固和离子交换。液-液色谱柱不那么受欢迎，因为它们的稳定性有限且不方便。在液-固色谱柱中，固定相为固体，分析物吸收到固定相上，从而分析混合物的成分。通常，HPLC在分析柱之前有一个保护柱，以保护并延长分析柱的使用寿命。保护柱的作用是去除色谱柱上不可逆的颗粒物、污染物和分子等。
最常见的HPLC色谱柱由不锈钢制成，也可以由厚玻璃，聚合物（例如聚醚乙酮），不锈钢和玻璃的组合或不锈钢和聚合物的组合制成。采用不锈钢材质的好处有很多，比如不锈钢相较于玻璃这种材质，更加的耐腐蚀，耐高压，耐磨损，使用寿命更长，这样也能很好的降低使用成本。典型的HPLC分析柱长3至25 cm，直径1至5 mm。与GC色谱柱不同，这些色谱柱通常是直的。填充柱的颗粒的典型直径在3至5 µm之间。当色谱柱内部堆积的颗粒直径减小时，液相色谱柱的效率将会提高。
峰或峰展宽会导致色谱柱效率降低。理想的情况将是尖锐的峰被解决。物质在色谱柱中停留的时间越长，将导致峰变宽。加长色谱柱是改善色谱柱中不同物质分离的一种方法。恒谱生色谱柱高流速，低背压，可累加柱效，高柱效、分离度佳，平衡时间短，缩短分析时间，节约溶剂。恒谱生色谱柱管有多种规格尺寸，比如4.6*50、4.6*100、4.6*150、4.6*250等，0.1μ、0.4μ的光洁度可选。
色谱柱通常需要保持恒温，以保持效率。塔板高度和理论塔板数决定了色谱柱的效率。提GX率将是增加板的数量并减小板的高度。
板数可以通过以下公式确定：
ñ=大号/ ħ（1）(1)N=L/H
其中L是列的长度，H是每个板的高度。
深圳市恒谱生科学仪器有限公司是致力于研发制造高质量色谱耗材的高科技生产厂家，我们在无气泡高净化能力的溶剂滤头、UHPLC超高压在线过滤器、较少死体积色谱保护柱、液相色谱柱、鬼峰捕集柱、0.1μ高光内表粗糙度柱管等领域具有多年的生产经验和较强大的制造能力。欢迎前来咨询了解！
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ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处
优化选择性
TFA和其他流动相添加剂与肽类和蛋白质的复合能力可用于调节选择性并改善分离度。如下图所示，将TFA浓度从0.1％降低至0.01％可使血管紧张素II和III实现分离。在超惰性ACE色谱柱的情况下，随着分离度的显著改善，峰形和灵敏度保持恒定。在Vydac色谱柱（填充有更具活性的固定相）的情况下，峰形被严重破坏。
选择性，随TFA的浓度而变化
色谱柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300Å
流动相：A：TFA（溶于水中）B: 80％TFA（溶于乙腈中），20％TFA（溶于水中），（按照上述说明为％TFA），15分钟内25％-40％B
流速：1.0 mL/min检测：UV 215nm
化合物：1.血管紧张素II
2.血管紧张素III
3.血管紧张素IACE 5 C18-300
超惰性硅胶Vydac 218TP
低纯度“活性”硅胶
通过降低TFA浓度来改善分离度。由低品质硅胶制成的色谱柱显示其性能降低。备注：比较性分离物不代表所有应用。
- ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处介绍Ⅰ
ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处
提高灵敏度
将TFA（三氟乙酸）用作肽类和蛋白质反相分离的流动相添加剂。
该添加剂通常被用于改善肽类和蛋白质复杂混合物的峰形和分离度。如下图所示，在流动相中使用0.1％TFA可以使填充有活性固定相的色谱柱产生与由超惰性固定相制备的新一代色谱柱相当的峰宽。
然而，随着TFA浓度降低至0.01％以及Z终的0.005％，超惰性相上的峰宽保持不变，但活性固定相上的峰宽会发生变形。
使用极低水平TFA分析肽类和蛋白质的能力有利于采用质谱法进行高灵敏度检测。TFA可与多肽形成复合物合并增强选择性。然而，该相同的复合作用会降低质谱仪的灵敏度。
用于肽类和蛋白质分析的ACE 300Å色谱柱
蛋白质
条件
色谱柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
温度：环境
流动相：A. 0.1% TFA（溶于水中） B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），30分钟内 5%-70% B
检测：UV, 280nm化合物
1. 核糖核酸酶A
2. 细胞色素C
3. 全铁转铁蛋白
4. 脱辅基肌红蛋白肽类
条件
色谱柱：ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速：1.0ml/min
温度：环境
流动相：A. 0.1% TFA（溶于水中）B. 0.1% TFA（溶于乙腈中），25分钟内10%-40% B
检测：UV, 220nm化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催产素
3. 血管紧张素II
4. 神经降压素灵敏度和峰形，随TFA的浓度而变化
色谱柱：250 x 4.6mm, 5μm C18 300Å
流动相：A：TFA（溶于水中） B： 溶于乙腈中的TFA（按照上述说明为％TFA），37.5分钟内10％-55％B。
流速：1.5mL/min
检测：UV 200nm化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催产素
3. 血管紧张素II
4. 神经降压素ACE 5 C18-300超惰性硅胶
Vydac 218TP低纯度“活性”硅胶
随着TFA浓度的降低，低纯度硅胶色谱柱（右图）显示性能急剧下降。
由超惰性硅胶制成的色谱柱（如ACE）会在TFA浓度降低时保持性能。备注：比较性分离物不代表所有应用。
沪公网安备 31011502008050号
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