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- 2360818807 2014-08-26 00:00:00
- 楼主你好： 由于近年来化学领域的快速发展氨基酸分析在生物化学、药学和临床研究上都有着广泛而重要的应用. 氨基酸的分离，尤其 是氨基酸对映体的分离一直是海内外的研究热门.在手性分离这一领域，GX液相色谱法（HPLC）一直 是Z广泛使用的方法. 目前GX液相色谱分离手性化合物主要有两种方法:一种是直接分离法，也就是利用手 性固定相直接分离手性化合物对映体. 王亚丽[1 ] 等曾用纤维素-三（ 3 ， 5-二甲基苯基氨基甲酸酯） （CDMPC） 手性柱在正相模式下拆分了3 种外消旋氨基酸的衍生物. 另一种是间接分离法，目前主要是 柱前衍生化法———将手性化合物柱前衍生化，将对映体转化为非对映体，进而使用常规柱完成分离分析. 离多种氨基酸的对映体，将化学计量学方法引入丝氨酸对映体重叠峰的分析，可以一次性地定量分析多种氨基酸对映体.所用衍生剂为邻苯二甲醛（OPA） 和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC） [2 ，3 ] . NAC是一种手性硫醇，其它手性硫醇如N-乙酰-D-青霉胺（NAP） 、N-异丁酰-L-半胱氨酸（ IBLC） 、N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC） [4 ] 也可与OPA 一起做为衍生剂. 1. 1 试剂与仪器 DL-丝氨酸（上海丽珠春风生物技术有限公司） ;L-丝氨酸、β丙氨酸、DL-丙氨酸、L-丙氨酸、DL-苯丙 氨酸、L-苯丙氨酸、DL-缬氨酸、L-缬氨酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠、乙酸钠（ZG医药团体上海化学试剂公司）;邻苯二甲醛（以下简称OPA ，ZG医药团体上海化学试剂公司） ;N-乙酰-L-半胱氨酸（以下简称 NAC ，Lancaster 公司） ;甲醇（HPLC 级，Merck 公司） ;高纯水. 除甲醇和水外其他试剂均为分析纯. 美国Aglient HP1100 GX液相色谱仪（DAD 检测器） ，ChemStation 化学工作站. 美国Aglient8453 UV - Vis 光谱仪. 1. 2 样品预处理[5 ] 各氨基酸样品配制成浓度约为0. 01 M 的水溶液.硼酸缓冲液的配制:硼酸（0. 01 M） 、氢氧化钠 （0. 01 M） 和水按体积比50∶45∶5 配制得到pH 为9. 3的硼酸缓冲液.衍生剂的配制:将53. 3 mg OPA溶于50 mL 甲醇得到OPA 甲醇溶液. NAC 溶于硼酸缓冲液中（0. 00286 M） . 取12 mL OPA 甲醇溶液、10mL NAC 硼酸溶液，添加3 mL 硼酸缓冲液至25 mL ，得到OPAPNAC 衍生剂. 1. 3 衍生反应 将0. 1 mL 氨基酸与5 mL OPAPNAC 衍生剂彻底混合5 min 后过滤进样分析. 1. 4 色谱前提 ZORBAX Eclipse XDB - C8 色谱柱（4. 6 mm 3 150mm ， 5μm） . 不同比例的甲醇和0.05 M醋酸钠水溶 液为活动相，流速1 mLmin - 1 ，进样量20μL. 所有的色谱分离均在室温下进行， 在线检测波长为334 nm ，DAD 检测波长范围为190～400 nm. 非负矩阵因子分解（NMF） 计算截取的数据波长范围为320 nm～390nm. 1. 5 数据处理方法 本实验采用非负矩阵因子分解（NMF） [6 ] 计算两个混合组分的纯谱. 非负矩阵因子分解是在“非负” 限制约束前提下的一种矩阵分解新方法，它的基本思路是将非负矩阵V 分解成两个非负因子矩阵W 和H.NMF 算法中采用了乘法更新公式（见公式（1）和（2） ） ，所以不必采用其它限制前提即能保证分解 结果“非负”. 2. 1 氨基酸对映体的分离 氨基酸与衍生剂的反应天生异吲哚类产物[7 ] ，反应方程式见图1. 由紫外丈量得到的图谱可看出， 此类衍出产物在230 nm 和334 nm 处各有一个Z大吸收 . 但因为230 nm 处较易受干扰，故在色谱实验中除了记实全波长数据外，选择334 nm 作为检测波长. 下文中所提到的氨基酸色谱峰均为其经由上述衍生化后所得到的衍生物的色谱峰. 结果表明，在甲醇∶醋酸钠溶液为30∶70 的淋洗前提下，除DL-丝氨酸的两种对映体有部门重 叠外，DL-丙氨酸、DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸的对映体能得到基线分离，但是DL-缬氨酸的两种对映体出峰时间为17 min 和25 min ，DL-苯丙氨酸的两种对映体出峰时间为38 min 和43 min.此分离前提下，不仅铺张活动相，而且峰形不理想. 假如将活动相的比例调节至45∶55 ，固然可使DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸的对映体在10 min 内洗脱出峰，但将使DL-丝氨酸及DL-丙氨酸完全或部门重叠. 更多质量检测、分析测试、化学计量、标准物质相关技术资料请参考中检所标准品对照品 www.rmhot.com 考虑到DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸留存过强的情况，操纵中采用了简朴的梯度淋洗，在前三种氨基酸全部出峰后，改变活动相配比使DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸快速出峰. 淋洗方案如下:在0～6 min 内保持甲醇∶醋酸钠溶液为30∶70 不变，在6～7 min 由此比例线性变化至45∶55 ，在7 min 以后保持45∶55不变. 各对对映体的定性采用左旋光学纯标样通过内标法确定.β丙氨酸没有手性，没有对映异构体，只有一个色谱峰. 2. 2 波谱解析法的使用 尽管采用梯度洗脱，此谱中仍有一对重叠峰—丝氨酸的两个对映体. 在这种情况下， 假如要定量分析此体系，知道两组分的实际峰面积是必须的. 我们使用非负矩阵因子分析解析出两组分的纯谱 ，但此结果与实际纯谱还存在一个系数关系，即AXD-Ser BXL-Ser = YDL-Ser .为得到两组分实际的纯谱，我们用Z小二乘回归（ least squaresregress ， LSR） 来计算系数A 和B，得到的结果如下 : A = 72. 59 ; B = 75. 98. 此系数乘以各自组分的纯谱即为两组分的实际峰面积. 2. 3. 1 尺度曲线的建立 采用单一对映体标样在不同浓度值下的色谱峰面积或峰高建立尺度曲线. 实验中选用L-丙氨酸和L-苯丙氨酸作为两种标样，L-丙氨酸对应甲醇∶醋酸钠= 30∶70 的色谱前提，L- 苯丙氨酸对应甲醇∶醋酸钠= 45∶55 的色谱前提. 以浓度对峰面积或峰高进行线性拟和，得到尺度曲线方程 . 通过此方程可以测定混合样品中两个标样组分的浓度. 2. 3. 2 其它组分相对浓度预告 在同样的色谱前提下，体系中各组分的含量比与其色谱峰面积比成线性关系. 各组分的峰面积和所占面积面分比结果见表1 ，其中D-丝氨酸和L-丝氨酸的单峰面积是根据上述化学计量学方法计算而得.
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- 超纯水在LC-MS生物医学分析中的应用
LC-MS的强大功能已经得到了生物医学实验室的认可。1,2现在的LC-MS仪器已经从研究到常规临床实验室范围广泛使用，并有效应用于以下领域：
· ZL药物监测 - 测量血浆，血液或组织中的药物（例如免疫YZ剂）
· 滥用药物测试 - 测量在尿液或唾液中的药物（例如哌替啶，等等）
· 激素测试 - 测量血清或血浆中的激素（例如类固醇或甲状腺激素）
· 生物胺分析 - 测量血浆或尿液中的生物胺（如儿茶酚胺）
· 新生儿筛查 - 通过使用LC-MS水平监测氨基酸和酰基肉碱检测可ZL的疾病
LC-MS仪器相对于其他分析工具具有很强的吸引力，原因在于该技术能够以非常高的灵敏度同时测量多种复杂分析物。此外，速度和信任也是患者护理的关键因素，同时成功的LC-MS生物医学分析具有高度灵敏度，可追溯性强和数据可靠的特性。因此，对于生物医学用LC-MS工作流程中的试剂水及其水在LC-MS成功分析实践中的作用将通过以下三个方面进行介绍。
灵敏度
超纯水被广泛用于LC-MS流程的各个环节（图1），所以是导致实验数据鬼峰，基线噪音和高MS背景等这些原因的主要污染源。同时也会使仪器或方法的灵敏度下降，使一些低浓度分析变的困难3。为了避免干扰，确保检测到的分析物是来自样品，而非来自实验用水4，实验过程需要使用高质量的超纯水，避免数据偏差和再次污染5。
Figure 1. The role of water in the LC-MS laboratory
超痕量分析是LC-MS生物医学分析中的一个应用领域，在激素检测中，相较于其他实验成分，其中水的使用量是非常大的。因此将Milli-Q水（电阻率18.2MΩ·cm（25℃），TOC<5ppb）作为激素中雌二醇分析的实例进行分析。这个实验的结果如图2所示，其中MRM色谱图显示Milli-Q®水中不存在雌二醇，确保了分析方法的低检出限，使用标准加入法测得雌二醇浓度为265.40ng/L。
前体离子273m/z和碎片离子255m/z用多反应监测（MRM）ESI+转换。HPLC和MS以及LC-MS/MS的仪器参数以及制备Milli-Q®水所用水源，见图2。
Figure 2. MRM chromatogram (ESI+) of estradiol in a sample and in Milli-Q®water.
可追溯性
水纯化系统的在线监测功能使科学家们确定他们所使用的水是否符合LC-MS分析的要求。但是，当问题产生时，说明LC-MS分析过程中已经出现了污染，找到并消除其来源至关重要，因为污染隐患来源非常多，使用LC-MS实验时收集记录的水质参数的数据可以在特定的日期与污染源联系起来，从而促进水质评估和问题的排查。
而且，在所有临床实验室中，可追溯性都是质量管理体系中的重要需求，能使实验室符合认证，例如，ISO15189：2007标准或CLSI®C3—A4。所以，在这种情况下用电子方式记录水质参数的方法是一种确保高质量认证的解决方案。
可靠性
为了满足LC-MS生物医学实验室的要求，水源必须可靠。所以水纯化系统不仅要生产高质量的实验用水，而且这个质量必须始终如一。为确保水质的一致性，使用在线监测工具。水中的离子含量通过电阻率测量来评估，通常电阻率18.2MΩ·cm（25℃）的水表示不含离子杂质。
为了检测有机污染物程度，可用可氧化总有机碳（TOC）计算;TOC低于5ppb的水（或μg/L）适用于LC-MS实验。因此，要检测水质的稳定性需要连续监测Milli-Q®水质的电阻率和TOC参数。图3显示了Milli-Q®系统提供的水质稳定性在线监测数据。
Figure 3. Levels of Resistivity (MOhm·cm) measured continuously and TOC (ppb) measured every 3 minutes as a function of volume produced by a Milli-Q® water system. Different colors refer to data obtained for three different sets of consumables installed by turns.
结论
超纯水适用并符合LC-MS生物医学分析实验的要求，而且良好的水质对实验的高质量和稳定性至关重要。临床实验室LC-MS实验 可以使用Milli-Q®水净化系统即能符合LC-MS仪器高灵敏度的要求还可以获得可靠和可追溯的分析结果。
References
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8. Millitrack? e-Solutions, A unique set of data management and monitoring software solutions for water purification systems, MilliporeSigma; www.emdmillipore.com/millitrack-esolutions
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