本文转自http://www.easylabplus.com/index-news-describe-html-749.html

  鬼峰是液相色谱中Z常出现的问题之一，鬼峰来源多种多样，理论上讲，在HPLC系统中任何一个节点均有可能引入鬼峰，依据鬼峰出现的频率，其主要来源于溶剂问题，仪器问题、流动相残留气泡以及操作不当等。主要分为以下几种情况 ：

1.溶剂问题 

a有机溶剂 

  甲醇制备工艺相对乙腈来说较为简单，杂质含量也较少。但是由于甲醇紫外吸收范围比乙腈广，所以当使用紫外检测器时，尤其是波长较低时，尽量使用乙腈作为有机相，用甲醇的话漂移太大。而用作梯度色谱的乙腈质量要求较高，一般用进口梯度色谱专用乙腈能够很好的减少鬼峰的出现。 另外如果有机相使用完后未更换新的流动相瓶，而是采用直接添加补充的方式也有可能会产出鬼峰。

b水 

  很多单位用自制蒸馏水作为水相，但是结果并不是很好。原因就是一些低沸点的有机杂质并不能够通过蒸馏除掉。有条件的尽量用HPLC级的纯水，没有条件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替，但是如果色谱条件比较严格也是有可能出问题的。 此外，水相要现配现用，避免微生物滋长。

c其它试剂 

  缓冲盐、TFA、EDTA等试剂也会对流动相造成很大的影响，尽量用纯度高的试剂配制流动相。

2.仪器问题

a液相的流动相管路被污染 

  长时间的使用含水量较高的流动相（尤其是加入缓冲盐的），细菌就容易在管路中滋生，细菌的代谢产物或是细胞碎片能造成鬼峰。

b检测器样品残留 

  多为一些样品组分在检测器流通池内的残留，其特点具有先后针之间的重复性差，或者没有重复性，色谱峰峰形特别尖锐类似大的毛刺。该种情形下，需要对流通池特别是石英视窗进行彻底清洗(联系工程师或者严格按照manual进行)

c单向阀堵塞 

  造成系统压力不稳，从而产生鬼峰。早期岛津的液相单向阀貌似不能用纯乙腈作为流动相，现在应该已经得到改进。  

d色谱柱中组分残留 

  色谱柱可对流动相或系统流路内的强保留污染组分起到富集作用，在有机相比例随梯度程序变化的过程中而被冲洗出来。在使用较长的色谱柱的时候尤其值得关注，因此，在水相不确定是否有杂质存在的条件下，梯度运行后的再平衡时间尽可能的短，一般以10倍柱体积为宜。

3.流动相残留气泡

  保留时间一般不可重现，即使流路中气泡连续存在，鬼峰出现的位置亦不可预测。可将流动相超声或鼓He脱除气泡并打开purge阀，大流速冲出仪器管路中的气泡，来减少气泡引起的鬼峰现象。

a在线脱气机脱气不完全 

 a在线脱气机脱气不完全。

b两种流动相的有机相比例相差太大 

  例如A为水，B为乙腈。在梯度条件允许的情况下尽量减少两中流动相之间的差距，降低空气在两中流动相中溶解度的差异，从而减少气泡的产生。 

c流动相配置好后预先超声脱气 

  c流动相配置好后预先超声脱气。

4.操作问题 

a流动相配置过程中受到污染 

  盛放流动相的容器或是样品瓶受到污染：这种污染可能来自于洗涤剂、铬酸洗液或是其他实验人员用完后的残留杂质。流动相容器的清洗一般用干净的水+有机溶剂涮洗就行，过多的清洗步骤反而可能造成二次污染。有时流动相容器的塑料盖碎片都有可能是杂质的来源。对于样品瓶污染情况下的鬼峰，容易排除，仅需要分别将样品溶解或稀释用的试剂以及进样小瓶更换，即可确定鬼峰的来源。

pH计：很多pH计以聚碳酸酯作为外壳，然而聚碳酸酯是可以溶于有机溶剂的，所以尽量使用玻璃pH计来测量流动相的pH。

滤膜：劣质的或者型号错误的滤膜往往是鬼峰出现的原因。

放置时间过长：流动相在空气中暴露时间过长，就可能吸收空气中的有机杂质，有时流动相中的添加剂，例如TFA，时间长了会氧化从而产生杂质。

  由自动进样器引入的鬼峰：自动进样器在进样之后，部分样品溶液残留在进样针头以及针座之上，对下次进样别的样品的结果产生干扰，出现鬼峰。对于一些强吸附性组分，尽管进行程序洗针，有时依然可能会引入鬼峰。针对这种情形，可在仪器平衡之后，分别进样不同试剂的Blank以及不进样，比较得到的图谱，基本可确定鬼峰是否来源于进样过程。

b样品稀释液与流动相极性或者pH相差太大 

  这也是导致鬼峰的原因之一，这种问题很有可能导致样品分为两个不同的阶段出峰，从而产生双峰或者多峰。

鬼峰对于反相液相色谱来说，是经常遇到的问题，对分析方法造成干扰并影响分析结果的准确性。从上面的讨论可以看出，尽管鬼峰的来源多种多样，基本应对原则就是，找到鬼峰的来源，更换流动相或更换添加剂或对仪器被污染部分进行清洗，在实验中避免不正确的操作。

做液相色谱的同学基本都会碰到分叉峰，

很多时候，

这都意味着硬件或者方法某些地方可能出现问题。

今天我们就一起看看导致峰分叉的原因，

以及如何解决这个问题。

首先，我们需要判断，

这到底是一个峰，还是两个峰?

a图主峰前面有一个肩峰，

这到底是峰形不好，

还是另外一个化合物没分开呢?

判断方法

降低该成分在样品中的浓度

b图是降低该成分浓度后，

进样后得到的色谱图。

如果这是一个峰，

那肩峰也应该响应变小，

但是这个例子里，

肩峰没有变小，

这应该是另外一个化合物。

这时候，我们就要考虑如何改变方法

将这两个东西分开。

如果所有峰的峰形都不好

一般来说，

一个样品都会出多个峰。

峰形不好，绝大多数时候

在每个峰上面都会出现。

比如像下面这样：

a图是所有峰都拖尾，

b图是所有峰都有肩峰，

也可以说峰分叉，

这种情况一般都是色谱柱头塌陷

或者柱头的筛板被堵导致的。

为什么会导致峰形问题呢？

请看下面的图

a图是正常的柱头，

b图是筛板被堵的柱头。

正常情况下，

所有样品分子都是均匀通过色谱柱，

形成一个对称的峰形。

堵塞的情况下，

有一部分样品分子进入色谱柱就会受到阻扰，

导致时间拖后，形成拖尾。

对于色谱柱塌陷的情况，

用同样的方法大家也不难理解。

只不过这时候，

是一些样品分子可能跑的比正常的快了一些。

如何解决这个问题呢？

1  反冲

柱出口放空，

冲20-30ml流动相。

虽然柱子上都有表明使用方向，

但是对于硅胶基质的色谱柱

基本都可以反冲。

将柱头污染物

如泵密封圈的碎屑，

样品中的污染等冲走，

就能解决问题。

当然，还是要提倡大家注意

样品上机之前的前处理

和及时更换磨损的泵密封圈。

有条件的还是用保护柱，

大不了就换保护柱，

也比换色谱柱强。

2  更换或清洗筛板

现在估计做这个事情的人不多，

但是谁有废柱子，

想练练也未尝不可。

我们一起看看一个实际的例子

根据之前说的，

可能是柱头堵了，

或者塌陷了。

但是进一步检查，

发现另有原因。

方法用的150 mm 4.6 mm, 5 um C18 柱子，

78% 乙腈，1.5ml/min，等度方法，

进样10ul，100%乙腈溶解的样品。

一般来说，

虽然10ul的纯乙腈不会引起峰形不好，

但是有时候样品溶剂的极性跟流动相差异较大时，

的确会引起峰形的问题。

我们怎么办呢？

01

从最容易的办法做起，

降低溶剂乙腈的比例，

降到50%看看。

从下图b，4min的峰可以看出，

没啥改观。

02

接下来反冲柱子，

结果如图c，

基本没变化。

算了，明天再说吧。

03

第二天来到实验室，

还能干嘛呢? 

更换筛板?

算了，直接换柱子吧！

结果如d，

噢，好很多噢。

之前柱子肯定有问题，扔了。

但是峰还是有点宽，

估计还是哪儿有问题。

手上忙，没时间管这个。

04

几天过后，

重新配了流动相，

一跑，好了，如图e。

虽然到底什么原因导致之前峰形的问题，

已经无从查找

（柱子扔了，旧流动相也没了），

但是也给我们提供了一个解决问题的步骤：

1

确定峰形问题

是所有峰都有问题，

还是就是某一个峰有问题。

如果所有峰都有问题，

基本都是色谱柱，

或者仪器管路连接的问题。

如果是某一个峰有问题，

那就要从方法上来考虑，

是否需要改变流动相比例，

pH值，色谱柱温度等等。

2

从最简单的做起

从不需要换什么东西的方法做起。

比如改变样品溶剂，

反冲色谱柱等等。

3

换东西

换保护柱，换色谱柱，

换流动相(新配)，

一步一步的换，

有助于找到问题的根本。

4

总结经验

问题解决后，

想想需不需要采取什么措施，

防止类似问题的发生，

比如说常换流动相啦，

及时更换密封圈啦，

记录进样次数

了解什么时候色谱柱就不行了啊之类的。

希望以上信息能够让各位同学

在碰到峰形不好的问题时，

有一些思路，

不至于手足无措。

也欢迎大家留言补充

上面没有提到的可能影响峰形的可能。

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3.鬼峰问题                                                    

3.1.等度分离中出现的意外宽峰是因前次运行产生的峰洗脱延迟（在等度分离中，前次运行中的迟洗脱组分以宽峰的形式意外出现）。

对于等度分离，保留时间越长，峰应（色谱峰）越宽；但色谱图狭窄区域内的所有峰应具有大致相同的峰宽。如图11（箭头）所示，当窄峰中出现宽峰时，可能是因为之前注射（前次进样）的化合物发生了洗脱延迟。这很容易检查。

只需进行正常注射（进样），但将运行时间延长两到三倍。如果在正常运行时间结束后出现峰值（出峰），那就是因洗脱延迟导致的。

可以通过延长正常运行时间，以涵盖此峰的洗脱（洗脱时间将峰洗脱出来）；也可以在每次运行结束时加入强溶剂冲洗液，以（来）清洗柱中的顽固物质。

图11.峰延迟洗脱通常在38.5分钟时出现（迟洗脱峰（正常情况下在第38.5分钟出现的洗脱峰）），位于（出现在了）下一个缩短的等度运行的色谱图的12.0分钟（箭头）处。来源[6]。

3.2.通过运行非注射（无进样）空白梯度并观察基线，可以分离梯度运行中的鬼峰。

如图12a所示，当空白梯度出现过多的峰时，试剂污染可能是导致此问题的原因之一（可能是溶剂污染所致）。

在这种情况下，图12a显示运行过程中的峰值（峰）非常小（1-3 mAU），并且在0.8-1.0 AU范围内的主要成分分析中几乎没有峰值（对0.8-1.0 AU大小的主要成分检测峰没有影响）；但是对于稳定性（性指标检测）或杂质的测定，1-2 mAU范围内的峰值应需要量化（也需要定量）。

在这种情况下，则需要进一步的研究。

在梯度运行之间的平衡期间，流动相中的非极性杂质一般沉积（聚集）在柱的顶部位置。然后，在梯度过程中，像其它峰一样，这些杂质被洗脱出来。

通过将平衡时间延长至三倍，检查问题的根源。如果空白梯度中的峰值（峰）增加约三倍，则水状溶剂Z有可能是问题的致因（则极可能是水溶液中的杂质所致）。

如图12b所示，可将水和/或添加剂换成纯度较高的成分，以解决这一问题。

图12. 运行空白梯度：（a）A容器受到污染的水（A容器中溶剂有杂质）和（b）A容器中纯度较高的水。色谱柱：150x4.6mm C18；1.5mL/min；35℃；在255 nm处进行UV检测。梯度：0-83％ACN /水运行13分钟，并保持5分钟。来源[7]。

3.3.等度或梯度运行的负峰不如正峰常见（相对于正峰较为少见），但也会发生。

负峰在离子对或其它方法中更为常见，其中流动相试剂在选定的检测波长下具有显著的紫外线吸光度（倒峰在有离子对或流动相在检测波段下有明显紫外吸收的情况下更为常见）。

在这种情况下，背景吸光度将极为重要（背景吸收可能较显著）（可能为0.5 AU或更多），但不会被注意到（较难觉察），因为系统在每次运行开始时会自动调节至零点，并检测信号。

如果化合物的吸光度低于流动相背景（背景吸光度），其会显示为负峰。

致因的确认和峰的消除方式与正峰相同（确认问题来源并消除倒峰的方法与正峰相同）：检查水、试剂或样品的制备过程。

近年来随着高效液相色谱仪的检测器灵敏度和色谱柱峰容量的提高，可以在极低浓度下进行检测，但鬼峰问题却成为了人们关注的焦点。恒谱生今天就跟大家聊聊鬼峰产生原因和解决措施吧!

一、什么是鬼峰：
       如果化合物出现的时间少于预期的保留时间,则称为鬼峰”。这将显示为与注入同一色谱图的化合物具有不同保留时间的峰。色谱中的鬼峰是在小于预期保留时间的间隔内出现的不需要的峰。这些峰通常是由其他化合物或代谢物与溶剂和固定相的相互作用引|起的,这会导致分离度降低，使评估分离质量变得困难。

二、鬼峰的来源：

      鬼峰的来源通常分为三类：目标物质以外的杂质、LC仪器的内部污染和流动相中的杂质。

(1) 仪器中的杂质

      仪器中产生鬼峰的最常见原因是进样器造成的残留。当将针头浸入小瓶中吸取样品时，样品中的物质会成为残留物的来源，因为它们可以吸附到针头的内外表面。那些即使在针头冲洗后也没有被去除的物质被带到下一个分析中，并以鬼峰的形式出现。由于即使在多次空白分析（仅注入流动相的分析）后也会出现表现出特别强吸附的物质，因此可能很难将自动进样器识别为鬼峰的来源。

(2) 样品中的杂质

      当样品中存在与目标化合物吸收波长相同的杂质时，就会产生鬼峰。由于来自样品的鬼峰不会出现在空白注射中，因此确定来源相对容易。

(3) 流动相中的杂质

     ①流动相中因长时间使用而产生有机物或空气中的有机物溶解在流动相中

     ②由于长期用新流动相补足现有流动相而不是每天或为每组样品准备新瓶而导致流动相被污染

     ③使用受污染的有机溶剂和/或水制备流动相

     ④使用受污染的流动相试剂

三、出现“鬼峰”怎么办：

       如果早期峰是由于样品引起的，那么它实际上不是鬼峰，而是分析中需要考虑的真实样品峰。光散射是表征这些大聚集峰的一个很好的工具，因为即使没有可用于确定摩尔质量的浓度信号，仍然可以确定大小（RMS 半径）和数密度。如果样品中大颗粒的峰渗入其他样品峰，您可以调整目标样品峰的基线以排除较大颗粒的贡献。如果空白注入也能看到鬼峰，那是真正的鬼峰了。

       要消除或防止这些鬼峰：在加载和注入步骤中使用压力变化最小的 HPLC 系统。请注意，加载期间的压力仅显示在前面板上，通常不是 HPLC 数据文件中记录的数据的一部分。如果鬼峰或系统峰在多次空白注射中可重现，您可以使用 ASTRA 的基线减法程序从样品注射中减去空白注射的光散射基线。选择脱落最少的液相色谱柱。逐渐改变流速（不超过 0.1 mL/min2）以防止大的压力变化冲击色谱柱。

       恒谱生的鬼峰捕集去除柱（又称鬼峰捕集小柱）可以有效吸附流动相中的杂质，从而缩短了方法验证和杂质分析的时间。鬼峰捕集去除柱主要的特点是能够去除溶剂包括有机溶剂中的杂质。反相色谱梯度分析时，将鬼峰捕集小柱安装在梯度混合器和自动进样器之间，不仅能够去除流动相中的杂质，还可以有效捕集管路和混合器中的杂质。

       今天恒谱生分享的知识先到这啦，希望对您的工作有所帮助！

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