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4.6 冻干产品的贮藏与复水

4.6.1 真空或充气包装

已干燥产品是一种疏松的多孔物质，有很大的内表面积。如果暴露于空气之中，就会吸收空气中的水分而潮解，增加产品的残余水分含量。其次，空气中的氧、二氧化碳与产品接触，一些活性基团就会很快与氧结合产生不可逆的氧化作用。此外，空气中如含有杂菌，还会污染产品。因此，在产品干燥后，能直接在真空箱内密封，使之不与外界空气接触。现在比较先进的冻干机都具有这种功能。因此，冻干产品的贮藏应该从第二阶段干燥结束以后开始。

由解吸等温线可知，在平衡条件下，产品中吸附水分的量在给定温度下是水蒸气压力的函数，如图4-53所示。在给定温度下，在很短的时间内可近似认为是平衡状态，在第二阶段的工作压力应该小于平衡蒸气压，例如，当温度为+40℃，预期残余水分小于1%时，pch应该为几帕。如果产品（血浆）的温度只有+20℃，则工作压力应该比1Pa还小。通常情况，延长干燥时间不能降低残余含水量——只有升高温度才能降低残余含水量。要想得到较低的含水量，吸湿性的产品应防止在干燥室中再次吸入已被干燥除去的水分。如果使用小瓶，应在干燥室中密封。如果是散装的物料或食品，干燥后应该往干燥室中充入干燥空气或惰性气体。在+20℃，相对湿度为70%时，空气中的水分约为1.3×10-2gH20/L。往体积为200L的干燥室充入该气体时，将引入2.6g的水蒸气。如果干燥室中有300个小瓶，每个小瓶装有固体含量为10%的1cm3的物料，则残余含水量将增加约9%。如果固体含量只有1%，则残余含水量增加到90%。充入气体的露点应该与第二阶段的最终压力相对应，例如，最终压力为2Pa,气体的露点应为-55℃，最小应为-50℃。

因此，冻干产品应在二次干燥结束后采用真空或充氮气包装，包装材料的渗透性差，贮藏运输过程应避光。

4.6.2 冻干产品的复水

理论上，冻干制品复水后能恢复原有的性质和形状。实际上要让冻干后的产品完全恢复原有的特性，不仅受冷冻干燥过程影响，复水条件也是很重要的，比如复水液，复水速率，复水温度，复水率等都会影响复水后制品的特性。如人红细胞、角膜等在冻干过程中，大部分水分都被除去，要恢复其基本生理功能，必须进行复水，为细胞创造一个与体内细胞生存环境基本相符的条件。牛肉，方便米饭，牡蛎、海参等冻干的食品在食用的时候应复水恢复其原有的形状，色泽及口感等。咖啡、青霉素等药品在使用的时候应能速溶。不同的物料复水条件和过程都不一样，通常用实验的方法确定。

4.5.2 冻干产品的质量及其变化

假设冻干本身是在最优条件下进行的，而且在冻干过程结束时产品达到了预期的质量，冻干产品在存储过程，其质量变化至少受三个因素的影响：残余水分，存储温度及混合在包装袋里的气体。与其中一种因素有关的或在更多情况下与三种因素都有关的变化可分成以下四种情况：

①在与水分子的重组过程发生的变化和/或溶解性；

②干燥产品的化学反应；

③产品生物-医学活性的恶化；

④产品物理结构的变化，例如：由非晶形转变为部分或全部晶体结构的形式。

通常发生的变化可由这几种变化中的某几种解释。下面给出了几个典型例子。

Liu和Langer证明BSA，卵清蛋白、葡萄糖、氧化酶和β—乳球蛋白在37℃时溶解性迅速减小，并且如果在已干产品中加入了30%（质量分数）生理盐水缓冲液，则在24h内97%的产品将变为非溶解性的。由于水分而引起的聚集归因于分子间的S一S键。对于给定的白蛋白，如果RM为最优值则可减少聚集。

Zhang等人研究了在keratonocyte增长因子(KGF)重组过程重组介质对形成聚集的影响。若干添加剂可使聚集明显地减小，调节重组介质离子的强度发现也有类似的作用。优化重组条件可增加蛋白质可溶性的恢复；对于KGF，蛋白质溶解性的恢复与本身的、单节显性的组成有关。此外，Zhang等人还发现当用纯水重组时，白细胞素-2(Ⅰ)和核糖核酸酶（Ⅱ）在+45℃的温度下存储时聚集相当大。如果在重组水中加入肝磷脂或磷酸盐可明显减少聚集的长度。Shalaev等人研究了在RM<0.1%时，非晶形蔗糖对葡萄糖和果糖酸性催化转化作用。即使RH=0.1%，在50℃冻干蔗糖时，例如带有柠檬酸，也得经受酸催化转化，作者得出的结论是冻干带有蔗糖的酸性物质即使是RM很低也会产生能够进一步和其他成分起反应的物质。

Yoshika等人利用ONMR光错学研究了在存储过程中β-牛乳糖间的反应和水的迁移率有关。水分的增加也使自旋-晶格弛缓时间T₁增加，相互之间的反应与T₁的关系比pH值的关系还要紧密。设想可能是水的增加使酶周围的水的迁移增加，从而使酶的反应增加。带有少量水的冻干样品，也表现出比根据pH值和水的迁移率估计的还要快的反应速度，这可能是由冻干时所用的添加剂盐引起的。Yoshika等人也使用了NMR光谱学，但用的是¹H自旋-自旋独缓时间T₂。测得BSA和γ-血球素的T₂是随水合程度而变化的。冻干的BSA和BGG如果水分超过大约0.2%(g/g)蛋白质，则对聚集变得敏感。蛋白质质子的T₂在水分较低时就开始增加，且随水分的增加聚集也紧跟着增加。对于冻干的BGG，在水分>0.5g/g蛋白质时蛋白质质子的聚集和T₂都将减小。

Vromans和Schalks利用非晶形维库溴铵研究了水敏性药品的稳定性。在制剂中其分解主要取决于水的活度αW，而不是水分的多少。赋形剂的玻璃化不仅有低温保护作用，而且起稳定作用。Cleland等人发现当蔗糖和蛋白质具有适当的分子比率时，在40℃可稳定保存人类单克隆抗体重组细胞(ruhMAb HER2)33个月。360：1的摩尔比率可成功地稳定蛋白质。这比通常的制剂中所用的等渗浓度低3～4倍。Souillac等人比较了冻干和物理混合的h-Dnase、rh-GH和rH-IGF-1和甘露醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷的焓。对物理混合物，发现焓与蛋白质的百分含量呈线性关系；对冻干的混合物此关系是非线性的。作者得出的结论是在冻干的混合物中蛋白质和碳水混合物之间会直接发生反应。

Hsu等人发现已包装的产品也有可能发生分解。设想冻干结束时只具有单分子层的水，且不是均匀分布的，但是在有些位置分子可能连成串。在干燥和存储过程这些水提供的保护以防止变性。这点是由基因技术产生的两种产品证明的：太少的水，比单分子层还少，造成tPA和高铁血红蛋白在物理上的不稳定，然而较高含量的水却导致存储过程生物上的不稳定。

To和Flink以及van Scoik和Carstensen阐述了四种变化的例子：依To和FIink的观点，非晶形到晶体的转变或者是因为存储温度T(T>TC)太高，或者是因为吸收了水。（注：较多的水增加了非晶形固体的流动性，促进了晶体的成核和增长）。

Van Scoik和Carstensen交流了他们关于蔗糖晶体成核和增长的经验。讨论了温度和残余水分这两个成核参数，建议用添加剂可停止、延缓或加速成核。用来清洗装有小瓶的干燥室的气体和加入产品的包装袋里的气体的影响尚且不清楚。只是氧气在多数情况下被排除。Spiess建议用干空气存储花椰菜和蓝莓，然而胡萝卜和辣椒粉应该存储在氧气含量<0.1mgO₂/g干物质的气体中。对于药品，病毒或细菌，无法给出普遍的建议，由于CPA、添加剂的结构、缓冲剂的影响都应考虑。

所有气体的纯度也应该做详细说明，由于一定量的杂质对存储特性有可能起决定性的作用，例如从瓶塞中解吸出的气体。Greiff和Rightsel证明流行性感冒病毒在没有CPA的情况下当RM为1.6%时在氨中的传染性保持得非常好。如果使用通常的存储温度，在氩中，传染性减小大约10倍，在氧气中减小20多倍。Corveleyn和Remon冻干了两种不同的包含25mg二氢氯噻的药片制剂。药品用PVC/铝塑包装、聚偏二氯乙烯(PVDC)/铝塑包装、带干燥剂的密闭容器和非密闭容器在60℃以三种RH，45、60和85%存储。一个月后，除了包装在PVDC/铝塑包装中的药片以外，其余药RM都由2.7%增加到6.8%。水分为7.2%的制剂崩塌。PVDC/铝塑包装中药片的水分的增加或减少非常慢。用于包装冻干药片的材料没有一种能阻止水分的吸收和结构的崩塌。

4.5.1.3 热重分析法

热重分析法(TG，TG/MS)是在程序控温下，测量物质的质量随温度（或时间）的变化关系，用来研究材料的热稳定性和组分。检测质量最常用的办法就是天平。热重分析仪如图4-47所示。May等人描述了在称量过程中，如何区分质谱仪的读数是解吸出来的水的还是挥发性物质的，挥发性物质有可能来自残余溶剂或部分产品的分解。

当前卤素快速水分测定仪是一种新型快速的水分检测仪器，其原理就是利用热重分析法。

May等人用TG，TG/MS，KF法和一种命名为“蒸气压湿度测量法”(VPM)的新型测量方法研究了α-干扰素和美国标准百日咳疫苗的残余水分(RM)。VPM测量密闭小瓶中物料上面的空间中水的蒸气压。来自红外二极管的光线穿过小瓶到达图像探测器。小瓶的温度从室温以固定的速率冷却到一55℃。当水蒸气冷凝的时候，由于凝结物使光束变暗，从而改变图像探测器的信号。凝结温度可转化为压力，从而可计算出顶部空间中水的微观图。图4-48表示α-干扰素的TG值。抽取的三种不同样品中，发现RM的平均值为1.15%土0.15%。利用KF法发现一种样品中的RM为1.28%。图4-49表示百日咳疫苗样品9的相应数据。水的最终解吸温度和开始分解的温度由重量随时间变化的函数的导数曲线确定(%/mi)；当导数曲线偏离水平线时可认为水的解吸结束。在表4-1总结了不同方法我得的结果，VMP不能提供关于产品RM的值息。该方法可重复测量同样的小瓶在一段时间内产品上空的水分，从而确定水分的变化量。

4.5.1.4 红外光谱学

Lin和Hsu描述了用近红外线(NIR)光谱学确定密封的玻璃瓶中蛋白质类药品的残余水分的方法。研究了五种蛋白质：人类单克隆抗体重组细胞(ruhMAb)E25、ru- hMAb HER2、rubMAb CDI1a、TNKase和rt-PA，在小瓶壁的水平位置上加入适量的MilliQ水可使残余水分的量增加，使水蒸气扩散到已干产品。一般情况下，1～2天后可达到平衡状态。利用常用的三种数学工具来确定复杂光谱（不同成分的重合部分或它们之间的化学反应)。研究了下列因素对IR标准的影响结果：赋形剂的浓缩，块状产品的疏松度，厚度和直径以及赋形剂和蛋白质的比率，Karl Fischer滴定数（也叫RF)被用来作为与NIR数相比较的标准。

图4-50中(a)～(e)表示5种产品RF和RNIF之间的关系。Karl Fischer滴定法依每日的操作者的不同其波动范围为士0.5%。因此，RF和RNIR之间的差别≤0.5%认为是较好的。在30～100mg/mL之间疏松度的变化≤0.5%。块状物的尺寸必须超过NIR的透深，否则测得的RNIR太小。

制剂成分允许有小的变化，然而变化较大时，例如，蔗糖由42.5mmo/L变为170mmol//L，随着浓度的增加吸收率增加（图4-51）。因此对85mmol/L的RNIR的标准不能用于蔗糖的浓度较低(42.5mmo/L)或较高(>120mm0l/L)的情况；在520cm-1时水的信号随着产品信号的改变而变化。通常情况下，对于给定的制剂和产品尺寸RNIR标准是一定的，只有在NIR测量对于充足的被反射光线具有足够长的光程以及校准产品的光谱随组分浓度的改变没有被改变的情况下，变化才是允许的。

4.5.1.5 残余水分测量方法的比较

干燥产品中的水以多种形式结合：如存在于表面的水，或多或少与干物质结合的水或以结晶水的形式存在着的水。因此，对于不同的物质，各种方法有可能会产生不同的结果。利用重量分析法和Karl Fischer滴定法测得的有些物质的RM值几乎是没什么不同的。May等人提供了四种这类物质的例子，但是如表4-2所示，利用重量分析法得到的RM值比Karl Fischer滴定法得到的小0.3%～0.6%，然而，用热重分析方法得到的RM值在误差范围内与Karl Fischer滴定法得到的值是非常接近的。在图4-52中比较了在第二阶段干燥过程，利用KF测得的RM和利用DR值计算得到的dW值。用于KF测量的小瓶当时是封闭的，上面的图表示出了平均值以及误差条。同样的药品在同一台设备上，在相同的工艺条件和相同的装载量的情况下进行了三次试验过程。利用KF测得的RM值在MD转变为SD后以士1%改变，约21h后减少为土0.5%。三次试验过程dW值都在SD阶段开始后以士0.5%改变，在21h后小于0.05%。上下曲线表明，到达最终温度后，进一步的干燥不可能再降低RM的值0.5%。根据dW也可得到相同的信息：在21h后水的解吸可忽略，由于其小于0.02%/h。此产品在所选的工艺条件下，用KF法测得1.5%的水分在此温度下及可接受的时间内不能用解吸法除去。