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- 意祥福 2018-04-08 10:41:34
- 建议仔细查看一下质谱图,旧柱子上的出峰是什么,是否和代谢物相关,有没有可能是旧柱子上的残留物?
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峰形问题
可能致因
预防措施/解决方案
峰拖尾
与活性硅醇的相互作用
使用超高纯度硅基(硅胶基质)固定相
添加碱性流动相添加剂(如TEA)- 超高纯度相则不需要
在固定相中与金属离子螯合
同上
错误的流动相pH值(流动相pH值不当)
降低流动相pH值以YZ硅烷醇电离
增加缓冲液浓度
玻璃料阻塞(筛板堵塞)
倒冲洗柱(反冲色谱柱)
使用串联(在线)过滤器
柱无效(色谱柱失效)
倒冲洗柱(反冲色谱柱)
更换柱 (色谱柱)
死体积未清扫(过大)
尽量减少连接器数量
使用较短的连接管
检查所有配件是否紧固
分裂峰
保护柱或分析柱入口(进样)端污染
拆下保护柱卡套(卸除保护柱芯)并进行分析 - 必要时更换保护柱
倒冲洗(反冲)分析柱
对于顽固残留(强保留污染物),应尝试再生法(对色谱柱进行再生)
更换柱
玻璃料阻塞 (筛板堵塞)
倒冲洗柱(反冲色谱柱)
使用串联(在线)过滤器
样品溶剂与流动相不兼容
在流动相中注入样品 (用流动相溶解样品)
同时洗脱第二组分
注射前使用样品清理 (进样前先净化样品)
通过改变流动相或柱相(色谱柱固定相) 来改变选择性
柱超载(色谱柱过载)
使用更高容量的固定相
增加柱的直径 (增加色谱柱内径)
减少样本(样品)量
伸舌峰
柱中通道的形成 (色谱柱内形成通道)
更换柱 (色谱柱)
在建议的色谱柱(色谱柱建议的)pH值范围内操作
柱超载 (色谱柱过载)
注入更少量或更稀释的样品溶液 (减少进样体积或进一步稀释样品)
使用更高容量的固定相
样品溶剂与流动相不兼容
在流动相中注入样品(用流动相溶解样品进样)
低温
增加柱的温度 (升高柱温)
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气相色谱仪在进样后检测信号没有变化,不出峰时该如何应对呢?
1、降低色谱柱恒温槽的温度,冷却色谱柱后,检查载气系统是否正常,载气是否进入仪器,以免损伤色谱柱或污染检测器。
2、检测器火焰是否正常。如果检测器火焰不能点着或容易熄灭时,可以对点火线圈、点火极、气体的流量、TCD钨丝及钨丝电流设置等进行检查,以排除故障。
3、检查注射器是否存在问题,如堵塞等,并且需要对进样口和检测器的石墨垫圈是否漏气、色谱柱是否有断裂漏气等进行检测。
4、检查样品浓度、样品进样量是否正确,是否存在问题。
5、对色谱柱温度、进样器温度、检测器温度、量程设定等分析条件进行检查。
6、确保仪器各部分正确连接及正常运行,如离子信号线与检测器、放大器电路板的连接,输出信号线与仪器、积分仪/工作站的连接等。
7、如果无法正常调零,需要对电路系统进行检查,以排除故障,如信号线、放大器电路板、输出信号线、积分仪等是否出现故障。
8、观察检测器出口是否畅通,这点也格外重要。
- 作为方法开发中的正交相色谱柱 - ACE CN-ES
结合CN的极性选择性与增强的疏水性
ACE CN-ES液相色谱柱
• 用于UHPLC和HPLC分离的新型固定相技术
• 用于方法开发的替代极性选择性
• 高柱效2μm、3μm、5μm和10μm颗粒
• 超惰性,可获得Z佳性能和可重现性
ACE CN-ES液相色谱柱
分离机制 相互作用的强度 偶极-偶极相互作用强 强 疏水性结合的相互作用 强 目标分析物
极性和非极性分析物
具有双键和三键的分析物
疏水性不同的分析物
在传统CN键合相上保留不佳的极性分子
所推荐的分离
强极性、极性和非极性分析物的混合物
适用于NP和RP分离
传统CN键合相显示稳定性/寿命不佳的分离
典型C18色谱柱不能提供充分分离的应用
作为方法开发中的正交相
ACE CN-ES液相色谱柱可以提供替代选择性
样品:1)甲硝唑 2)苄醇 3)氢氯噻嗪 4)香草醛 5)对羟基苯甲酸甲酯 6)1,2-二硝基苯
流动相:A = 0.1%甲酸(溶于水中) B = 0.1%甲酸(溶于90:10甲醇/水中)
梯度:在5分钟内3 - B
色谱柱尺寸:50 x 2.1mm流速:0.60ml/min
温度:40℃ 波长:254nm为什么ACE CN-ES液相色谱柱可以提供替代选择性?
■ 将极性CN基团与延长的间隔区相结合,可以提供与C18色谱柱类似的保留
■ 与具有短链烷基间隔区(通常为C3/丙基)的传统CN键合相相比,延长间隔区技术可额外延长柱寿命ACE CN-ES 可以提供与C18色谱柱相似的保留
中性化合物在RP条件下的分离
样品:1)尿嘧啶 2)邻苯二甲酸二甲酯 3)甲苯 4)联苯 5)菲
流动相:60:40 乙腈/水
色谱柱尺寸:150 x 4.6mm流速:1.00ml/min
温度:22℃
波长:254nm
使用甲醇或乙腈的替代选择性
多模式相互作用对分离的优势
样品:1)1,3-二羟基苯 2)儿茶酚 3)氢氯噻嗪 4)氧烯洛尔 5)水杨酸 6)杨梅素 7)吡罗昔康 8)1,2-二硝基苯 9)托美汀 10)1-萘酚 11)胡椒碱 12)二氟尼柳
13)丙基苯 14)1,2,3-三氯苯流动相:A = 0.1%甲酸(溶于水中) B = 0.1%甲酸(溶于乙腈中)
梯度:在10分钟内3 - B
色谱柱尺寸:100 x 2.1mm流速:0.60ml/min
温度:40℃
波长:210nm
NSAIDs的快速梯度
样品:1)2-乙酰氨基酚 2)乙酰苯胺 3)水杨酰胺 4)阿司匹林 5)非那西丁 6)水杨酸
流动相:A = 0.1%甲酸(溶于水中) B = 0.1%甲酸(溶于甲醇中)
梯度:在3.75分钟内5 - 38% B,保持38% B直至第5分钟
色谱柱尺寸:50 x 2.1mm流速:0.60ml/min
温度:40℃
波长:240nm
在UHPLC上利用增强的选择性
采用UHPLC分离类固醇
样品:1)可的松 2)皮质酮 3)11α-羟孕酮 4)可的松-12-乙酸酯 5)11-酮孕酮 6)β-雌二醇 7)17α-雌二醇 8)17α-乙炔基雌二醇 9)雌酮
流动相:A = 0.1%甲酸(溶于水中) B = 0.1%甲酸(溶于乙腈中)梯度:在5分钟内25 – 52.5% B
色谱柱尺寸:50 x 2.1mm流速:0.40ml/min
温度:40℃ 波长:260nm
ACE CN-ES与正相条件兼容
在NP条件下用取代芳族化合物进行的保留比较
样品:1)丁苯 2)苯甲酸甲酯 3)硝基苯
流动相:90:10庚烷/乙酸乙酯
色谱柱尺寸:150 x 4.6mm流速:1.00ml/min
温度:22℃
波长:254nm
产品的可用性和规格
相
官能团
封端
粒径(µm)
孔径(Å)
表面积(m2/g)
碳载量
Z大pH范围
水相兼容
USP列表
ACE CN-ES
具有专有延长烷基间隔区的氰基
是
2, 3, 5, 10
100
300
12.6
2.0-8.0a
Yes
L10
- 色谱柱能否为我的分析物提供良好的峰形?
ACE和ACE Excel硅胶基质固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响,并且在为碱性化合物提供zhuo越峰形方面赢得了口碑。
峰拖尾可以降低分离度,降低灵敏度,甚至干扰准确度和精密度(图4)。
峰拖尾有许多潜在的原因,但分离碱性物质时的主要原因是硅胶固定相载体颗粒表面上的酸性硅醇基与分析物上的氨基之间的相互作用(图5)。
图 4:峰拖尾对分离度和灵敏度的影响
随着峰拖尾(Tf,拖尾因子)从1.0增加到2.0,分离度(Rs)从1.5下降到0.87。
由于峰宽增加以及峰面积保持不变,灵敏度(峰高)也随着峰拖尾的增加而下降。
ACE色谱柱采用具有极低硅醇活性的超惰性硅胶制成。
这种超纯硅胶采用ZL技术进行有效键合和彻底封尾。
导致这种硅胶基质的固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响。
ACE色谱柱的超惰性特性使其成为分离极性碱性化合物的理想选择。
当分离复杂碱性化合物时,与其他现代碱性去活色谱柱相比,ACE色谱柱总是能给出明显更好的峰形和柱效(图6)。
图 5:峰拖尾相互作用
硅胶固定相载体表面上的酸性硅醇基可形成与碱性化合物相互作用的离子交换位点。
这种离子交换的相互作用通常可以导致峰保留(二次保留),并当采用反相HPLC分离胺类化合物时引起峰拖尾。
一种几乎消除了硅醇基对色谱分离不利影响的硅胶基质固定相
图 6:峰拖尾比较
条件
色谱柱尺寸:50 x 2.1 mm
流动相:40%甲醇,60%水
流速:0.2 mL/min
温度:22ºC
样品:吡啶报告了碱性化合物(吡啶)在各种常见C18色谱柱上的塔板数。
在10%峰高下测量塔板数,以使峰拖尾纳入在测量中。
ACE C18-PFP由于其超惰性性质而达到了Z高塔板数。
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适合化学小分子方法开发的ACE色谱柱组合特点介绍
固定相名称
特点
适用的化合物
反相色谱柱,根据特点解决非极性至极性化合物
ACE EXCEL C18
纯经典疏水C18,单一的疏水选择性
广泛的有机化合物
ACE EXCEL C18-AR
C18结合苯基,相当于同时具备C18,苯基,亲水AQ柱的选择性,水稳定, 与单一的苯基柱相比,在MS下的流失极小等同于C18,特别适合方法开发
疏水化合物,小至中等极性化合物,芳香性化合物
ACE EXCEL C18-PFP
C18结合五氟苯基,相当于同时具备
C18,五氟苯基,亲水AQ柱,及构型的选择性,水稳定,与单一的五氟苯基柱相比,在MS下的流失极小等同于
C18,特别适合方法开发
疏水化合物,中至大极性化合物, 芳香性化合物,位置异构体,同分异构体等,发现更多杂质的利器
ACE EXCEL SuperC18
chao强惰性的宽PH C18,酸性体系下对碱性化合物有极好峰形,碱性体系下
(PH=10.5)有很长寿命及柱效,
优于同类的宽PH柱,适合需要通过变化
PH值的方法开发用户
疏水化合物,大极性碱性化合物在反相下获得很好保留与分离度的需求(碱性体系下使用)
ACE EXCEL C18-Amide
C18结合酰胺基,相当于同时具备C18 与酰胺基的选择性,水稳定。相比其它公司的Amide柱,耐水,
MS下与C18一样的低流失,超好的重现性与寿命,适合方法开发用户
疏水化合物,大极性的有机酸,酚类,氨基酸,氨基酸盐酸盐类
ACE EXCEL CN-ES
长碳链结合氰基,同时具备类似C18与CN的选择性,水稳定,非常适合方法开发;
疏水化合物(物别有双键,叁键差异的化合物),取代传统CN,获得重现稳定性与寿命,可正相条件下使用
核壳快速分析宽PH反相柱
Ultracore SuperC18
是核壳chao强惰性的宽PH C18,酸性体系下对碱性化合物有极好峰形,碱性体系下(PH=10.5)有很长寿命及柱 效,优于同类的宽PH柱,适合需要通过变化PH值的方法开发用户,2.5u核壳有与1.7u全多孔一样的柱效,但压力低约一倍,寿命更长,适合UPLC快速低压的方法开发需求
疏水化合物,大极性碱性化合物在反相下获得很好保留与分离度的需求(酸、碱性体系下使用)
Ultracore SuperPhenyl- Hexyl
是核壳chao强惰性的宽PH 苯基己基柱, 酸性体系下对碱性化合物有极好峰形, 碱性体系下(PH=10.5)有很长寿命及柱效,优于同类的宽PH柱,适合需要通过变化PH值的方法开发用户,2.5u 核壳有与1.7u全多孔一样的柱效,但压力低约一倍,寿命更长,互补于C18的选择性,适合UPLC快速低压的方法开发需求
疏水化合物,芳香化合物,大极性碱性化合物在反相下获得很好保留与分离度的需求(酸、碱性体系下使用)
表2:
Hilic反相下解决特大极性化合物的需要(流动相典型为高比例CAN与小比例水,避免用甲醇)
ACE-EXCEL Hilic-A
Hilic色谱柱,酸型交联
适合Log P为负值的特大极性化合
物,在反相柱上难以或极弱保留的化合物的保留分离,对碱性物质特异选择性
ACE-EXCEL Hilic-B
Hilic色谱柱,丙胺型交联
适合Log P为负值的特大极性化合
物,在反相柱上难以或极弱保留的化合物的保留分离,对酸性物质特异选择性
ACE-EXCEL Hilic-N
Hilic色谱柱,羟丙基型交联
适合Log P为负值的特大极性化合物,在反相柱上难以或极弱保留的化合物的保留分离,通用型
其它独立选择性柱
ACE EXCEL NH2
可再生NH2
单糖,乳糖,蜂蜜中糖检测
ACE Sil
正相Sil
大豆磷脂类,其它需正相的色谱柱
ACE EXCEL C18-HL
高碳载量C18
分离单一疏水差异极小物质
ACE EXCEL Phenyl
独立苯基
适合芳环类化合物的单一特别作用
ACE EXCEL C8
独立C8柱
单一需求C8的用户
ACE EXCEL AQ
独立亲水柱
适合反相下单一极性化合物
所有ACE产品均为超惰性硅胶基质,对碱性化合物有Z佳峰形,基本对Et3N免疫!所有色谱柱有各 种粒径(1.7u,2u,3u,5u,10u),长短(20-300mm),内径(0.075-50mm)组合选择。
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