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蛋白质浓度测定的各种方法及原理是生物化学和分子生物学实验中的重要环节。蛋白质浓度的准确测定对于研究生物分子相互作用、蛋白质功能和动力学、以及生物样品的分析和鉴定等方面都具有重要的意义。本文将介绍几种常用的蛋白质浓度测定方法及其原理，包括紫外吸收法、微量凯氏定氮法、双缩尿法、Lowry 法和考马斯亮蓝法等。通过对这些方法的比较和分析，可以更好地了解它们的优缺点，以便根据实际实验需求选择合适的方法来测定蛋白质浓度。

①紫外吸收法

检测原理：

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，进行蛋白质含量的测定。

方法特点：

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。

干扰物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质。

检出限：50~100ug蛋白含量。

适用范围：适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

②微量凯氏定氮法

凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法，可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。

实验原理：

样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

方法特点：

优点：通用性强，测定费用低，易实现，仪器简单且测定结果的重复性和重现性好。

缺点：实验耗时长、灵敏度低。

检出限：0.2~1mg蛋白含量。

适用范围：凯氏定氮法测的是总蛋白的量，一些非蛋白氮无法检测出。

③双缩尿法

实验原理：

双缩尿（NH3CONHCONH3）是两个分子经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱溶液中，双缩尿与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽链，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。

方法特点：

优点：适合检测总蛋白质的含量，操作简单、测量速度快。

缺点：标准物质必须使用代表性很强的样品，需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，故测定工作费力费时。不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。

检出限：测定蛋白质含量测定范围为1-20mg蛋白质。

干扰物：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

适用范围：常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

④Lowry 法

Lowry 法是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是最灵敏的蛋白质测定方法之一，在生物化学领域得到广泛的应用，目前分为基本法和改良简易法，改良简易法可获得与基本法相近的结果。

基本法实验原理：

显色原理与双缩尿法相同，但加入了Folin-酚酞试剂，以增加显色量，从而提高检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：①在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。②Folin一酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

特点：

优点：灵敏度高。

缺点：耗费时间长，操作时间需精-准控制，标准曲线绘制麻烦，专一性较差，干扰物质比较多。

检出限：可检测的最-低蛋白质量达5ug。通常测定范围是20~250ug。

干扰物：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。

适用范围：除蛋白含量测定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

⑤考马斯亮蓝法

实验原理：

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最-大吸收峰的位置（max），由465mm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595mm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

方法特点：

优点：灵敏度比Lowry高约4倍，高效率、检测过程简便、只需要一种试剂，抗干扰能力强。

缺点：测定误差大，不适用于不同蛋白的检测。

检出限：其最-低蛋白质检测量可达1ug。

干扰物：干扰物质少，但去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、0.1N的NaOH会干扰实验测定。

蛋白质含量测定方法选择

蛋白质含量测定时，考虑以下因素后选定适用的检测方法。

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；

②蛋白质的性质；

③溶液中存在的干扰物质；

④测定所要花费的时间。

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随着科技的不断发展，凝胶被广泛应用于化工、食品、制药等各个行业，在人们日常生活中占据越来越重要的地位。化工方面，橡胶软化剂的应用，吸附剂、催化剂和离子交换剂的使用；食品方面，常用的稳定剂如明胶、槐豆胶、果胶、黄原胶、结冷胶、琼脂、海藻酸钠等，不仅可以保持食品柔软疏松、光滑细腻，还能增强食品的稳定性和均匀性；生物材料中，有重要作用的细胞膜和肌肉筹备的纤维都是凝胶状物体；医药方面，凝胶以优良的成型性、弹性、释药性和无害无发生反应等优点，在治疗外表等疾病方面广泛应用。

凝胶是胶体存在的一种形式，其性质介于固体和液体之间，有一定的弹性、强度，但结构强度有限，凝胶强度，是反映凝胶质量的一项重要指标。正确检测凝胶强度，对于凝胶的生产和科研、特别是用于食品和药品级凝胶的生产和科研，保证临床应用，均具有不容忽视的实际指导意义。

 济南赛成自主研发生产的TA-3000质构仪（又叫凝胶强度测定仪）是专门用于测试各种凝胶的凝胶强度的仪器，该仪器采用高精度力量感应元，数控电子线路自动抓取压力值，胶体破裂时，自动锁定凝胶强度值；TA-3000质构仪为数显自控，具有操作简便、稳定性强、较好度高、测试结果数据化等优点，被广泛用于食品、制药、化工和生物材料等领域。

凝胶强度测定方法如下：

1. 仪器和设备 

济南赛成TA-3000质构仪

2. 测试原理

在规定的条件下，向直径为 12.7 mm 的圆柱内压入含 6.67 %明胶溶液的胶冻表面以下 4 mm 时，所施加的力代表凝胶强度，以 Bloom g 为单位。

3. 测试步骤

在冻力瓶中配制6.67 %试样溶液120 mL，加盖，在10 ℃±0.1 ℃低温槽内冷却16 h～18 h。将冻力瓶从恒温水槽中取出，迅速放在质构仪或凝胶强度仪圆台上。目标模式选择距离4 mm，测试速度选择0.5 mm/s或1 mm/s，测定凝胶强度，样品测试需在2 min内完成。

4. 测试结果

直接从TA-3000质构仪中读出测定的凝胶强度数值，单位以Bloom g表示。结果取整数，取平行测定结果的算术平均值为测定结果。重复性条件下获得的两次单独结果的较好差值不得超过10 Bloom g。

TA-3000质构仪可以量化各种树脂、凝胶类样品的物理参数，通过特定探头对凝胶进行测定，从而得到样品的凝胶强度。在实验过程中，测试距离，测试速度，测试模式等高度可调，探头多套可选，可以获得多个产品的多个指标，功能强大，对企业原料质量控制、配方研究、生产工艺研究、质量控制和产品研发等方面有重要的指导意义。

济南赛成仪器一直致力于为大部分国家客户提供高性价比的整体解决方案，公司的核心宗旨就是持续创新，打造高精尖检测仪器，满足行业内不同客户的品控需求，期待与行业内的企事业单位增进交流和合作。

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