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　　在本应用示例中，我们展示了如何从μ-Slide VI 0.4通道载玻片中洗脱培养后的贴壁细胞。该方法适用于不同规格的通道载玻片。

　　1.根据实验说明将您的细胞培养到所需的汇合度。

装有细胞和培养基的μ-Slide VI 0.4

　　2.从μ-Slide VI 0.4通道载玻片的通道口中取出培养基，不要吸干整个通道。

　　3.用PBS或任何其他适当的缓冲液清洗两次，然后从另一端吸出。每个通道使用体积为100μl。我们建议同时使用细胞培养吸引器和移液器。如图所示，使用吸引器的尖端和移液器。

µ-Slide VI 0.4的一个通道的横截面显示了PBS洗涤步骤

　　4.使用细胞培养吸液器从通道中吸出全部PBS

在这个步骤中，缓冲液从容器口和通道中完全去除

　　5.立即用30μl分离溶液（例如胰蛋白酶/EDTA或Accutase）重新填充通道。如图所示，将移液器吸头直接放在通道的入口上。

将30µl分离溶液填充到空通道中

　　6.再将您的细胞放入培养箱中。由于生长面积和体积的纵横比不同，分离过程可能需要比平时更长的时间（2-3分钟）。用相差显微镜观察细胞脱离。如果没有发生分离，请增加分离溶液的浓度或使用更长的孵育时间。

细胞会在几分钟后分离

　　7.细胞成圆形并分离后，用100μl新鲜培养基或终止溶液冲洗每个通道

分离的细胞被100µl新鲜培养基冲出通道

　　8.从通道的另一端取出细胞悬液。如果还剩一些细胞，请重复冲洗步骤。

　　9.收集悬浮细胞并去除或稀释分离溶液

在细胞悬浮后，可以通过从通道中吸出溶液来收集

　　1. 基本信息

　　下面的应用描述了小鼠巨噬细胞系RAW-264.7（生物安全等级2）在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室载玻片的培养方案。这是一个特殊的细胞系的例子，用于显示粘附时间，细胞密度和细胞形态的示范。本应用可根据您的具体实验要求进行调整。

　　2. 材料

　　在设置中应用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·µ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·µ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 细胞培养与材料制备

　　在将细胞接种到玻片中之前，按照常规的方法培养细胞。

　　µ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培养基，在37℃和5%CO2培养箱中培养过夜。这对于避免随着时间的推移出现气泡至关重要。为此，在50 ml器中填充适量的培养基，并轻轻地将瓶盖拧紧。在 µ-Slide 8孔载玻片开放孔井中，气泡可排出到大气中。

　　拆开µ-Slide的包装，把它放在µ-Slide支架上，并在准备细胞悬浮液时同时将盖子放在 Luer 适配器/孔上。

　　4. 播种细胞

　　分离细胞：

　　吸出培养瓶中的培养基，并用PBS洗涤细胞一次。每75cm² 烧瓶中加入3-5 ml的Accutase，并将烧瓶放入培养箱中以加快分离速度。如果是RAW-264.7细胞系，则大约需要8分钟。使用Accutase分离的细胞存活率更高。

　　4.1. 将细胞接种到µ-Slide VI 0.4中

　　在µ-Slide VI 0.4建议的细胞浓度：最终细胞数  0.3 x 10 5 cells/cm²，制备浓度6 x 10 5cells/ml。通过将移液器尖端直接放在通道的入口上，将30 µl细胞悬浮液填充到每个通道中。将盖子盖在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小时以固定细胞。

　　细胞贴壁后，分别用60 µl无细胞培养基填充储液池。 避免将移液器吸头直接指向通道的入口。将玻片放回培养箱中。

　　图1：接种后一小时，在ibiTreat µ-Slide VI 0.4（货号80606）中的RAW-264.7

　　图2: 在ibiTreat µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小时后

　　图3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培养四天后

　　4.2 将细胞播种在µ-Slide 8 well 中

　　在µ-Slide 8 well建议的细胞浓度：最终细胞数 0.3 x 10 5 cells/cm² ，制备浓度 1.1 x 10 5 cells/ml。将300 µl 的细胞悬浮液注入各孔中。将盖子盖在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要进一步添加培养基。

　　图4：在ibiTreat µ-Slide 8 well(货号：80826)中的RAW-264.7，播种后1小时

　　图5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小时后

　　图6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，经过四天的培养

　　为获得最佳的分布的匀的细胞，我们建议使用像µ-Slide VI 0.4 这样的通道载玻片。在8孔腔室载玻片中，细胞密度可能会在孔的整个表面上因点而异，具体取决于细胞播种过程中的处理。

　　5. 免疫荧光染色

　　像往常一样为您的细胞固定和染色。

　　注意：在 µ-Slides 中染色时注意液体的处理

　　µ-Slide VI 0.4 ：更换液体，先吸出两个储液池而不排空通道。 如果您使用的是真空设备，请注意不要将吸头直接放在通道的入口上。 用100 µl新溶液冲洗通道3次。 从一侧添加新的溶液，通过通道流入另一个储液池，然后从另一侧吸出，直到两个储液池都排空。注意通道永远不要干涸！

　　µ-Slide 8孔载玻片：在 µ-Slide 8孔中，无需特殊处理措施。像在任何其他培养皿或孔板中一样的交换液体。

　　下文中，给出了使用以下材料对细胞核和肌动蛋白丝进行染色的示例：

　　细胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌动蛋白丝：Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室温下固定细胞10分钟。

　　2. 用PBS清洗细胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育细胞5分钟。

　　4. 用PBS清洗细胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分钟。

　　6. 用PBS清洗细胞三次。

　　7. 在0.2μm浓度下用鬼笔环肽Alexa For 488孵育细胞20分钟。

　　8. 用PBS清洗细胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育细胞10分钟。

　　10. 用PBS清洗细胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片剂重新填充。 现在样品可在显微镜上观察了。保存在阴暗阴凉处可储存数周。

　　图7：在 µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（细胞核、蓝色）和Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate（肌动蛋白丝，绿色）

　　1.介绍

　　本应用逐步说明了如何串联连接多个Luer-Slides。优点是仅使用一个流体单元即可观察和培养多个载玻片。当使用相同规格的载玻片时，载玻片中的流速是相同的。也可以通过连接不同高度的载玻片来改变剪切速率（例如，µ-Slide I0.2Luer和µ-Slide I0.4Luer）。

　　本次介绍了两个载玻片连接的过程。但是它可以应用于大量的载玻片。

　　2.材料

　　载玻片：2片 µ-Slides I 0.6Luer, ibiTreat                ibidi (80186)

　　细胞：Endothelial cells (2.5 · 105 per slide)          e.g. Promocell

　　培养基：Endothelial Cell Growth Medium            e.g. Promocell

　　连接器：Serial Connector                                      ibidi (10830)

　　注射器：带简单Luer适配器的无菌注射器（5 ml）

　　串行连接器：

　　管道：Silicone Tubing 1.6 mm ID                           ibidi (10842)

　　适配器：Luer Connector Male                                 ibidi (10824)

　　将一个塑料连接器插入通道载玻片的两端（6厘米），以在载玻片之间连接起来。下图是在两端带有两个配套的Luer公接头的连接器管。可用乙醇或高压灭菌消毒接头。

必须在无菌条件下执行以下步骤！

　　3. 播种细胞

　　· 准备1.67 · 106 cells/ml.的细胞悬液。

　　· 将150 µl注入通道。仅填充通道体积（图1a）。

　　· 将帽盖在Luer接头上，并将载玻片放在培养箱中培养半小时来固定细胞。

　　· 细胞固定后，将两边储液接口各加60 µl充满。

　　4. 连接载玻片

　　现在准备载玻片，使细胞在通道中生长，并向储液池中填充60 µl无细胞培养基（请参见第3节）。

　　· 在连接之前，将所有储液器各加60 µl（图1b）。

　　· 将连接器管的一个Luer适配器插入载玻片的一个母Luer适配器中（图1c）。

　　· 将一些预备的培养基吸入注射器。倒转注射器并将多余的空气推出（图1d）。

　　· 使用没有气泡的注射器在载玻片端口注入。可能会有些溢出（图1e）。

　　小心地将液体注入载玻片，直到连接器管中充满为止（图1f）

　　图1：（a）接种细胞时的用量； （b）载玻片在连接之前已完全填满； （c）载玻片中插入连接管； （d）无气泡的注射器； （e）将注射器插入载玻片一端； （f）用注射器推动介质来填充连接器管道

　　· 当连接器管道完全充满时（图2a），将其插入第二张载玻片的接口上（图2b-d）。

　　· 如果要连接两个以上的载玻片，将第二个连接器管放在第二个载玻片空的另一端口上，用注射器推入介质，依此类推。

　　· 慢慢连接的所有载玻片将注射器从适配器上卸下（图2e）。

　　· 要将载玻片连接到灌注套件，两个Luer容器必须在顶部填充培养基。可用纸巾擦去过多的培养基。

　　图2：（a）连接管已完全充满； （b-c）将连接器管插入第二载玻片的鲁尔接头上； （d）带有适配接头管连接； （e）取下注射器； （f）擦去溢出的介质，并填充储液罐以连接到灌注套件。

　　5. 连接到灌注装置

　　将载玻片连接到灌注套件

　　图片串联安装带有两个µ-Slides I Luer的一个流体单元

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　　1、超薄底部(符合Coverslip#1.5厚度标准，约0.17~0.18 mm)，适于高倍率显微镜观测。玻璃底可用于TIRF和单细胞应用；

　　2、含有独立的开放小室，“All-in-one”小室可以用来做细胞培养和显微观察；

　　3、简易快速的免疫荧光染色，不需盖玻片，无渗漏；

　　4、价格经济实惠，仅需少量的细胞和试剂；

　　5、多种底部可供选择，满足您不同的实验需求：

　　• ibiTreat底部：ibidi专利物理处理，超薄亲水，适合大多数细胞的贴壁培养，无需另外包被；

　　• 1.5H玻璃底：底部厚度仅为170µm，光学性能好，适用于更高要求的光学成像（如TIRF和单细胞应用等）

　　• 带格子的标准底：便于定位目标细胞/组织，确认是同一个观察对象，特别适合细胞或细胞簇的定位和重找回；

　　• 可移除底部：适用正置/倒置显微镜观察；适用于免疫荧光染色和长时间样本保存；

　　• 可粘载玻片：可粘附在任何表面上，适用于材料研发；

　　• Bioinert生物惰性表面：彻底的不贴壁，不吸附任何生物分子即便进行长时间的实验，非常适合培养悬浮细胞和细胞聚集体。

　　产品优势

　　左图是传统方法，右图是ibidi简易快速一体化的免疫荧光实验方法

　　ibidi ▶▶▶  活动说明：

　　本次活动均为一次性购买方可参与；

　　多买多送，上不封顶；

　　本次活动不可与其他活动叠加参与；

　　本次活动最终解释权归雷萌生物所有。

　　1.介绍

　　ibidi泵系统/流体剪切力系统是专为灌注条件下的长期细胞调节而设计。标准方法是将一个载玻片连接到一个灌注装置。在某些情况下，增加载玻片（细胞）的数量可能是有用的。例如，当计划进行各种染色时，或者如果细胞数量对于后续的应用（如FACS）不够时。

　　本应用是一个循序渐进依次连接µ-Slide VI0.4六通道载玻片的实验方案。

　　重要提示！

　　串联的通道承受着几乎相同的流速，因此剪切应力也几乎相同。

　　我们强力建议串联通道载玻片，而不是并联！

　　我们建议按所述方式连接不要超过两个µ-Slide VI0.4 六通道载玻片

　　2.材料

　　对于设置，需要以下材料(无菌):

　　* 串联连接管(ibidi #10830)，5 pieces

　　* 细胞培养基

　　* 接种了细胞的ibidi µ-Slide VI 0.4

　　* 灌流管

　　* 1 ml注射器

　　* 软管夹

　　* 移液吸头

　　重要提示！

　　将串联连接管、细胞培养基、通道载玻片和灌注装置在培养箱中平衡一整晚!

　　本方案的所有步骤都应在无菌条件下完成!

　　3.准备工作

　　整个设置相当于只有一个通道的标准实验。 区别是，在将整个组件连接到Perfusion Set之前，先将多个通道串行连接起来。

　　3.1.接种细胞

　　像往常一样在µ-Slide VI 0.4的通道中接种细胞。如果需要进一步的静态培养，让细胞附着并在附着后用60µl无细胞培养基填充储液池。详细说明见“使用ibidi流体剪切力系统培养内皮细胞实验方法汇总”。细胞贴壁后，就可以进行载玻片的串连了。

　　3.2.泵设置

　　按照“使用ibidi流体剪切力系统培养内皮细胞实验方法汇总”中的说明准备泵的设置。向灌流管的储液池中各注入5ml平衡介质，并以中压(约50mbar)运行泵，去除气泡。

　　重要提示！

　　将公鲁尔接头连接到母鲁尔接头时，务必小心不要带进气泡。

　　尽可能快地工作，以避免载玻片和细胞冷凝。整个过程必须在10分钟内完成。

　　4.串联连接

　　通道的串联连接是在细胞贴壁后和将载玻片连接到灌注管之前完成。

　　按照第3部分的描述准备载玻片，接种细胞并贴壁        如图所示，将五个串行连接管连接到Luer端口

　　用无细胞培养基填充注液孔，直到所有注液孔完全充满    在此步骤中，注意注液孔底部不能有气泡

　　注意不能在注液孔中留有气泡

　　用1ml的无菌注射器吸满培养基，小心插入如图的孔中，不要引入气泡。

　　小心慢慢注入培养基，直到第一个串联管有培养基微微冒出

　　小心的将串联管弯过来，插入相邻的Luer端口中。不要产生气泡。

　　继续推动注射器，直到第二根串联管也被充满，继续推动注射器充满下一根串联管。

　　重复上面的操作，继续充满所有的通道和串联管。

　　将所有的串联管连接好后，将加满液体排除气泡的灌流管用软管夹夹住。

　　从灌流管的母鲁尔锁定耦合器中拔出公鲁尔接头，并将其插入载玻片上末尾一个Luer端口中。在慢慢抽出注射器，用新鲜的培养基填满Luer端口并去除气泡

　　从灌流管的母鲁尔锁定耦合器中拔出第二个公鲁尔接头，并将其插入载玻片上另一端末尾的Luer端口

　　设置完成，可开始启动实验。别忘了取下软管夹！

　　串联灌流系统搭建完成。

　　5.调整流速

　　软件中无法预见多个通道载玻片的设置。需要调整泵的参数以适应新的要求。作为指南您可以在软件中选定正在使用是µ-Slide VI0.4通道载玻片。由此产生的流速(以及剪切应力)将低于在单通道的应用中。用所需的剪切应力启动一个循环，手动测量流速(ibidi Pump Instructions, page 40（可联系我们索要电子版文档）)。然后进入重新校准对话框，输入计算的（软件给定的流速）和测量的流速。