仪器网（yiqi.com）欢迎您！

实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团（探针或染料），利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过Cq或Ct值和标准曲线对起始模板进行绝对定量或相对定量分析。而评估荧光定量PCR反应效果好坏，可以从以下几个方面来评估：

1.扩增效率及相关系数

良好的PCR扩增是指数级的，理论上以100%的效率进行，但实际上并不是所有的PCR反应都表现出相同的高效率，所以需要验证实际的扩增效率E。当计算评估PCR扩增效率时，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，得到线性方程Cq= -klgX0+b、扩增效率E=10(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之间，即扩增效率在90-110%，被认为此扩增接近理想情况；相关系数R2值大于0.98时，说明两个数值之间相关的可信度很好，可用来计算。

▲ 图1. 5个梯度稀释液的扩增曲线及标准曲线。

图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

2.精确度（Precision）

指多个复孔Cq值之间的接近程度，且重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。

▲ 图2. 96孔重复的扩增曲线，Cq Mean=19.1，CV=0.002

图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

3. 重现性（Reproducibility）

指不同批次之间或不同实验室之间的结果变化，通常通过SD或者CV来评估。

▲ 图3. 4台独立的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统同时检测GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002

4. 灵敏度（Sensitivity）

通常灵敏度表示为检测限(limit of detection, LOD)，可通过梯度稀释样品来确定最低检测限。分析灵敏度是指一个样本可通过实验精确测量的最小拷贝数。

5. 准确度（Accuracy）

指测量值与真实值的接近程度。针对低拷贝样本，由于受采样概率的影响，可能会导致结果不准确。为了更可靠地检测低拷贝，可以增大平行实验的重复数，来统计显著性。

▲ 图4. 低拷贝样本采样概率符合泊松分布

图源：网络，侵删

6. 特异性（Specificity）

指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。

▲ 图5. 溶解曲线单峰

图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

通过这六个方面就可以评估实时荧光定量PCR反应效果。你学会了吗？实验数据是好是坏快来自检吧。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司，可为您提供3/6检测通道，根据实验需求灵活配置。这款产品采用高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。

溶解氧分析仪使用注意事项：

氧气通过周围的空气、空气流动和光合作用溶解于水中。工业溶氧仪是测量溶解在水溶液内的氧气的含量，可用来测量用来对氧含量会影响反应速度、流程效率或环境的流程进行监控如水产养殖、生物反应、环境测试(湖、溪、海洋)、水/废水处理、葡萄酒生产。

1、使用极谱式电极时，校正或测量前要预热至少15-30分钟。

2、为确保膜的电解液内没有气泡，ASI膜帽在设计上要求在装上膜头时要排除掉所有液腔内的空气。

3、膜表面上不能留有任何气泡，否则它会将气泡当作氧饱和样品进行读数。

即使使用的是带有自动温度补偿的仪表，也要在接近样品溶液的温度下校正电极。

电极应在空气中校正，以空气作为1**%的饱和溶解氧标准点。

由于电极对氧的消耗，探头表面氧的浓度会瞬间降低，因此测量时要对溶液进行搅拌，这很重要。如膜已破损则要进行更换。