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实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团（探针或染料），利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过Cq或Ct值和标准曲线对起始模板进行绝对定量或相对定量分析。而评估荧光定量PCR反应效果好坏，可以从以下几个方面来评估：

1.扩增效率及相关系数

良好的PCR扩增是指数级的，理论上以100%的效率进行，但实际上并不是所有的PCR反应都表现出相同的高效率，所以需要验证实际的扩增效率E。当计算评估PCR扩增效率时，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，得到线性方程Cq= -klgX0+b、扩增效率E=10(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之间，即扩增效率在90-110%，被认为此扩增接近理想情况；相关系数R2值大于0.98时，说明两个数值之间相关的可信度很好，可用来计算。

▲ 图1. 5个梯度稀释液的扩增曲线及标准曲线。

图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

2.精确度（Precision）

指多个复孔Cq值之间的接近程度，且重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。

▲ 图2. 96孔重复的扩增曲线，Cq Mean=19.1，CV=0.002

图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

3. 重现性（Reproducibility）

指不同批次之间或不同实验室之间的结果变化，通常通过SD或者CV来评估。

▲ 图3. 4台独立的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统同时检测GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002

4. 灵敏度（Sensitivity）

通常灵敏度表示为检测限(limit of detection, LOD)，可通过梯度稀释样品来确定最低检测限。分析灵敏度是指一个样本可通过实验精确测量的最小拷贝数。

5. 准确度（Accuracy）

指测量值与真实值的接近程度。针对低拷贝样本，由于受采样概率的影响，可能会导致结果不准确。为了更可靠地检测低拷贝，可以增大平行实验的重复数，来统计显著性。

▲ 图4. 低拷贝样本采样概率符合泊松分布

图源：网络，侵删

6. 特异性（Specificity）

指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。

▲ 图5. 溶解曲线单峰

图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

通过这六个方面就可以评估实时荧光定量PCR反应效果。你学会了吗？实验数据是好是坏快来自检吧。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司，可为您提供3/6检测通道，根据实验需求灵活配置。这款产品采用高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。

自1665年，英国科学家Robert Hooke发现细胞并命名为cell，到德国生物学家Matthias Jakob Schleiden和Theodor Schwann提出的细胞学说，人类对这个组成我们生命的相对独立单位——细胞，有了更加清晰的认识。

为了更好地了解生命的本质，揭示细胞基本的生命活动规律，科学家们围绕着细胞的增殖、运动、代谢、死亡等活动展开了一系列研究。其实早在19世纪，就有人提出将活体细胞从组织中分离出来的概念，但是直至1950年才开始进行动物细胞的培养研究。由最开始简单的观察到从组织中分离原代细胞再到获得可持续传代的无限细胞系，细胞从一个虚无缥缈的概念到现在作为体外研究实验时必不可少的实验材料，贯穿了整个生物学发展史。

研究常用的细胞主要分为两种：直接从组织上分离的原代细胞和购买的细胞系，通常将从组织上分离获得的第一代到第十代内的细胞统称为原代细胞，而大部分原代细胞会在此之后逐渐生长停滞并衰老死亡，极少量能继续存活至第五十代以后的细胞遗传信息发生了改变，成为无限细胞系或连续细胞系，一般的无限细胞系只具有永生性的特点，还有一些细胞的接触抑制消失，可以多层生长，甚至在异体接种后还有致瘤性。

因此无限细胞系由于其永生和快速分裂的特点一直是细胞水平研究时的首 选，由于方便培养、种类繁多、生长速度快且成本较低，可以快速开展研究，使得各种无限细胞系被广泛应用。例如Hela细胞作为第一株可无限传代的人类细胞系，帮助科学家们更加高效地专注人体细胞疾病和活性药物作用机制的研究，广泛应用于肿瘤学、免疫学、病毒学等学科领域。

近年来研究发现，虽然无限细胞系“浑身是宝”，但在应用上还是有一些限制。

限制1

细胞的生物学特性改变

在研究过程中由于需要大量的样本，无限细胞系需要快速繁殖并扩大培养，而其在连续传代培养过程中会发生一定突变，无限制地连续传代可能导致细胞系的基因型和表型都发生改变，从而影响实验结果。

同时，永生化的无限细胞系与活体组织内细胞的生物特性本身就有较大差别，并不能完全代表动物体内的真实环境水平，而原代细胞被认为更能代表体内组织的情况，在某些国家/地区已经得到了法律认可（Human Tissue Act2004，UK），尤其是在药物早期的毒性评估试验时，相较于无限细胞系，使用直接从患者组织分离的原代细胞是更加合适的实验模型。

限制2

细胞系交叉污染

细胞污染？大家第一反应都是病原微生物导致了细胞实验的失败，但是我们这里说的并不是说培养体系内细菌大量繁殖影响了实验，而是细胞系之间的交叉污染。顾名思义，就是你做实验用的细胞系内可能混进了其他种类的细胞！

这个问题可能是由于建立细胞系时导致的，也有可能是一些不当操作如同期多种细胞共养、耗材重复使用等，或者是由于一些细胞培养相关产品导致的，可能很不经意的一个操作便导致了整个实验的失败。2011年美国专门颁布了细胞STR鉴定国家标准，而目前仍有很多研究者们并未意识到这个问题的严重性，但是相关机构已经开始敲响了警钟：

2014年12月和2015年2月的Science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识的严重性，并强调污染带来的后果。不仅浪费了时间和精力，研究结论和结果不能复现，其带来的影响是十分严重的。因此NIH、ATCC等权威机构多次发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定。在 2015年4月，Nature宣布旗下所有杂志将要求作者鉴定论文中所用细胞系，同年6月即有报道称一科学家因细胞系问题，撤销了Nature论文；2017年10月发表在PLoS ONE期刊上的一篇文章发现30000多篇论文使用了HeLa细胞交叉污染的错误细胞系导致研究结果无效[1] ，2019年的研究表明，至少有24%的人源细胞系被HeLa污染了[2]。

限制3

细胞应用

很多细胞在体内体外培养中无法增殖，比如在使用神经元，骨骼肌细胞，心肌细胞，周细胞以及终末分化的肝细胞等进行实验时，每次都需要再次从新鲜的组织中分离原代细胞。

然而原代细胞最能模拟体内的生理环境，能保持一定的组织生物学特性，因此用于评估药效和毒力最为合适，同时被其他细胞系交叉污染的概率大大降低，另外肿瘤学和免疫学相关研究在制备活体动物模型时也必须要进行原代细胞的分离，但是原代细胞的培养难度远高于普通细胞系，同时，原代细胞的分离制备也一直是一个亟需解决的难题。在保证可重复性的前提下，如何高效率制备高活性的单细胞悬液样本呢？

瑞沃德单细胞悬液制备仪轻松化解这一难题，自主研发的组织处理管、酶解试剂盒和内置不同组织优化处理程序，可将组织制备成高活性单细胞悬液或组织匀浆。

使用该仪器可快速完成活性高、均一性好的单细胞悬液制备，大大增加实验可重复性。拥有独立运行的四通道，搭配加热套可提高组织处理效率。广泛应用免疫学、肿瘤学、神经生物学等研究领域。

紧接着，在原代细胞分离后要对单细胞悬液进行细胞计数和活力分析，并将细胞置于培养体系或相应的缓冲体系中。

活细胞计数的精 准度少不了外部的加持，自动细胞计数仪的使用可以对原代细胞进行精 准计数，瑞沃德C100自动细胞计数仪可配合多荧光通道，对悬液中的细胞进行定量分析，并同时显示明场及荧光图像，清晰呈现计数结果及细胞形态。适用于免疫学及疫苗开发、细胞治 疗、肿瘤研究、干细胞及代谢研究等研究领域的细胞分析。

C100自动细胞计数仪

细胞培养是原代细胞分离流程最后一步，瑞沃德二氧化碳培养箱，可精 准控制温度、二氧化碳浓度，并且是维持高湿度环境的高性能细胞培养箱。HEPA高效过滤器可有效去除空气中的微粒污染，140℃高温干热灭菌功能可实现培养箱的定期灭菌维护，为原代细胞样品提供稳定洁净的培养环境。

二氧化碳培养箱

【参考文献】

1. Serge P. J. M. Horbach， Willem Halffman. The ghosts of HeLa：How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS ONE， Published：October 12， 2017， doi：10.1371/journal.pone.0186281

2. Lin J, Chen L,Jiang W, Zhang H, Shi Y, Cai W. Rapid detection of low-level HeLa cell contamination in cell culture using nested PCR. J Cell Mol Med.2019;23(1):227–236. doi:10.1111/jcmm.13923