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      当前，我国年轻人单身比例攀升、人口老龄化加速，巨大的情感需求刺激宠物行业蓬勃生长。宠物再也不是家中的功能性角色，从Z初吃剩饭剩菜，到现在食用商业干粮，从Z初“看家护院”变成了如今人们心心念念的“孩子”、“宝贝”。

      宠物行业属于全产业链行业，涉及饲料、零食、玩具、兽药、YL等各个领域，发展潜力巨大。而在宠物行业领域中，宠物饲料作为宠物的刚性需求，在行业中份额占比Z高达34%。当前国内宠物行业处于蓬勃发展期，宠物饲料需求旺盛，市场前景良好。

     放在以前，虽然我国对饲料有具体的标准要求，但宠物食品(饲料)行业却尚属空白。没有严格的标准要求，许多小企业为了节约成本，提高利润，难免要偷工减料，产品质量无法保障。

      问题在今年有所改观，2019年1月1日后，宠物饲料卫生指标已经按照《宠物饲料卫生规定》要求执行，2019年9月1日后，宠物饲料生产许可管理和标签管理也将严格执行《宠物饲料管理办法》规定。

      值此时机，为进一步增强饲料管理部门监管工作规范性，提升饲料质检机构宠物饲料卫生指标检测水平，“宠物饲料管理制度及其卫生指标检测技术培训班”在上海举办。

       此次培训班由国家饲料质量监督检验ZX主办。现场，权威专家就管理方法及其相关内容进行了要点解读和培训，并向大家征求了进一步加强宠物饲料行业管理的意见。

      同期进行的仪器与技术展示环节为到场用户和科学仪器厂商搭建了沟通的桥梁。海能为大家带来了K1160全自动凯氏定氮仪、D100杜马斯定氮仪、Tank plus高通量微波消解仪、T960全自动电位滴定仪、P850 Pro全自动旋光仪等多款仪器以及相关仪器在宠物食品检测中的应用，以供体验参考。

      未来，海能将持续关注宠物饲料市场趋势，参照标准开发更多应用方法，积极反应用户需求，希望能为关注宠物营养与健康的您带来更多的参考和选择。

数字 PCR (dPCR)可以提供比传统qPCR更高的精准度和灵敏度，尤其是在肿瘤学应用中，dPCR能精准且可靠地检测到较低浓度样本中的稀有突变等。

目前，使用Drop-off方法可以同时检测基因组内发生的多个序列插入、缺失或碱基突变，最大限度地提高单个检测中样本的数据输出，节省时间和检测成本。本文以naica®微滴芯片数字PCR平台为基础，对使用Drop-off方法检测基因缺失进行阐述。

首先，为大家介绍一下Drop-off方法原理：

☑ Drop-off是指利用探针在一个反应中检测基因组序列的同源基因突变（包括核苷酸的缺失，插入和替换）。

☑ Drop-off方法包括两个TaqMan 探针：一个与野生型序列互补而与突变位点不发生互补的Drop-off探针和一个与突变型和野生型基因都互补的Reference探针（如下图A）。

☑ 当野生型等位基因存在时，Drop-off探针和Reference探针都将与目标序列杂交，产生双重阳性信号（如下图B，蓝色群）。相反，如果存在突变的等位基因，即使一个核苷酸的突变也会阻止Drop-off探针与之杂交，因此只有Reference探针与目标基因结合，从而得到一个阳性信号（如下图B，绿色群）。

A.Drop-off和Reference探针及引物在目标基因上的示意图（FP：上游引物，RP：下游引物）

B. Crystal Miner 2D图中显示来自双阳性野生型等位基因的荧光簇（天蓝色：蓝色和绿色）和突变等位基因的荧光簇（绿色）及阴性微滴簇（黑色）。Drop-Off探针仅和野生型序列互补，而跳过突变序列（图B，纵坐标的蓝色通道）；Reference探针与突变和野生型等位基因进行互补（图B中横坐标的绿色通道）。

野生型浓度CWT可以直接从双阳性微滴中PWT的比例得出。但是，Drop-off突变体浓度Cmut必须从确信包含突变等位基因的微滴比例Pmut中得出。

由于野生型和突变等位基因可能被分配到同一个微滴里面，因此采用双阳性微滴对突变体进行定量是不准确的，只能通过排除双阳性微滴来确定Pmut（将突变阳性群体定义为对Reference探针呈阳性但对Drop-off探针呈阴性的微滴）。

上文已对检测原理和检测方法进行了阐述，那么如何对Drop-off检测结果进行分析呢？

1、使用高灵敏naica®微滴芯片式数字PCR系统的蓝色和绿色两个通道对突变等位基因（MAF）进行绝对定量。

2、使用Crystal Miner分析软件进行量化分析计算。

A 、通过自主圈群功能选中三种微滴群体并进行命名-突变型阳性（绿色），双阴性（黑色），野生型双阳性（天蓝色：蓝色和绿色）。

B、通过naica Crystal Miner软件获得Drop-off突变型的浓度Cmut（绿色），以及野生型浓度CWT（天蓝色）。

C、计算MAF Drop-off突变，即MAF Drop-off=Cmut/（Cwt+Cmut）。

小提示：

如果不排除双阳性的微滴并将其归为阴性微滴中， Drop-off突变体的MAF则会被低估，对于任何Cmut＜100cp/µL，这一系数几乎是恒定的（例如在样品中CWT为500 cp/µL时，低估了25%）。保留双阳性微滴既不会降低测得的Drop-off突变体浓度的相对不确定性，也不会降低LOD。

应用亮点：

☑ 通过使用naica Crystal Miner圈群功能，可以对Drop-off突变进行精准定量。

☑ 排除模棱两可的微滴，在不降低测量精度的前提下避免了低估Drop-off突变体的浓度。

☑ 本次检测使用了naica®微滴芯片数字PCR系统的蓝绿两个通道，第三个检测通道还可以添加一个内部对照或同时量化一个MAF点突变。

naica®微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

naica®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的juedui拷贝数浓度。

抑郁症伴随多种行为表型，其中一个重要表现是快感缺失（Anhedonia），即个体无法从奖励或愉快的活动中体验到快乐。在动物模型实验中，通常用糖水偏好实验（Sucrose preference test，简称SPT）来测试快感缺失症状。

实验原理:

糖水偏好实验的原理在于，啮齿类动物天生对甜食有强烈的欲望，当给它们提供可自由选择即分别含有蔗糖溶液和普通水的两个饮水装置时，它们会有选择地喝甜味的蔗糖溶液。然而，当啮齿类动物处于以慢性应激导致的抑郁模型时，它们不会倾向性去喝蔗糖溶液。因此检测动物对蔗糖溶液的偏好程度可作为评估动物快感缺失症状及抑郁程度的有用手段。许多研究表明，1%-2%蔗糖溶液是区分小鼠或大鼠是否有快感缺失及抑郁的最佳浓度（参考文献1-4）。

实验设备:

整个实验需要用到一个Lickometer三联舔舐行为测试箱体（如图所示），整个箱体为聚碳酸酯材料，一端是不锈钢食槽，另一端有3个带有不锈钢小口的50mL聚碳酸脂饮水管子，上面有刻度读取相应溶液的体积，且易于取出进行清洗、测量和装溶液。箱体底部为不锈钢底板，为整个系统的舔舐行为的计数检测提供闭合回路。箱体外侧的三个计数器分别用于监测每个饮水管子单独的舔舐次数。如实验所需的舔舐液体种类少于三种，可用挡板进行隔开。

实验流程（参考文献5-6）:

整个糖水偏好实验包括适应、基线测定、测试和数据分析四个阶段，共耗时8天。(动物造模、给药等时间需要根据实验研究目的额外考虑）

适应(第1天-第4天)：

在此阶段中，装1%蔗糖溶液和普通水的两个饮水装置在动物饲养笼或实验测试箱体的对应位置，应每天更换，以避免动物产生位置偏好。

1. 蔗糖溶液适应：将分别含有1%蔗糖溶液和普通水的两个饮水瓶放置于老鼠的饲养笼中，连续放置48小时（第 一天5:00pm—第三天5:00pm）。

2. 实验设备准备：在第三天，用70%乙醇或无味消毒水提前清洁实验测试箱体，晾干后，在每个箱体的两个饮水瓶中分别放置新鲜1%蔗糖溶液和普通水，在食槽中放置适量食物。两个瓶子的位置应每天更换，以避免动物形成位置偏好。

3. 实验设备适应：第三天5:00pm，将第1步中适应好蔗糖溶液的老鼠从饲养笼中拿出放置到准备好的实验测试箱体中，此时老鼠能自由地接触两种不同的溶液（1%蔗糖溶液和普通水）以及食物。该步骤持续时间为一天（第三天5:00pm—第四天5:00pm），之后将小鼠放回原饲养笼（第四天5:00pm），给以普通的水和食物。

基线测定：

1. 提前准备好实验测试箱体（分别放置新鲜1%蔗糖溶液和普通水于两个饮水管子中，并在食槽中放置适量食物）。

2. 在第四天9:00pm，将上述实验鼠从饲养笼放置到实验测试箱体中，记录12小时（至第五天9:00am）内动物对两种溶液的舔舐次数；将动物放回饲养笼，给以普通的水和食物；清洁实验测试箱体，以备后续使用。

3. 在第五天9:00pm，将上述实验鼠从饲养笼放置到实验测试箱体中（为避免位置偏好，应更换两个饮水管子的位置），再次记录12小时（至第六天9:00am）内动物对两种溶液的舔舐次数，结束后将动物放回饲养笼，给以普通的水和食物。

4. 记录上述基线测试得出的2轮数据，用于后续数据的对比和分析。

测试：

测试前一天，将动物进行饥饿处理，即从第六天晚上9点到第七天晚上9点，把所有的食物和水瓶从动物饲养笼子里拿走。

1. 提前准备好实验测试箱体（分别放置新鲜1%蔗糖溶液和普通水于两个饮水管子中，并在食槽中放置适量食物）。

2. 在第七天9:00pm，将上述实验鼠从饲养笼放置到实验测试箱体中，记录12小时（至第八天9:00am）内动物对两种溶液的舔舐次数。

数据分析：

快感缺失被定义为，在糖水偏好测试中，动物对蔗糖偏好的降低。采用我们的Lickometer三联舔舐行为测试箱体，测的是动物对两种溶液的舔舐次数，而舔舐次数和溶液摄入量成正相关，因此我们可以直接比较舔舐次数：与普通水相比，蔗糖溶液的舔舐次数多则代表有蔗糖偏好；蔗糖溶液的舔舐次数减少则代表蔗糖偏好的降低，即表现出快感缺失，指示抑郁状态。

另外在没有舔舐次数计数装置的情况下，可以通过严格测量每次饮水管子内的溶液体积或者质量，计算出蔗糖偏好比：蔗糖偏好比=（蔗糖摄入量/总摄入量)100%（总摄入量为蔗糖溶液摄入量与普通水摄入量之和）。

注意事项:

1. 由于昼夜节律影响小鼠的饮水行为，选择固定的SPT时间很重要。本实验方案中所有的基线测试和最终测试均选在夜间。

2. 为避免其他因素对结果造成影响，建议使用蔗糖偏好比而不是绝对摄入量作为SPT的指示性参数。

3. 建议使用本方案中提到的舔舐行为测试箱体，可以避免饮水管子泄漏导致的实验误差；同时因为动物每次的饮水量很有限，在特定检测时长内若无法看出绝对摄入量的显著区别，统计舔舐次数或许会有数据差异。

4. 为避免动物饮水量异常，应严格控制蔗糖溶液的浓度和测试时长等因素。

应用拓展:

将该实验方案进行调整和优化之后，整套实验系统还适用于成瘾药物的依赖性检测。

【参考文献】

1. Goshen, I. et al. Brain interleukin-1 mediates chronic stress-induced depression in mice via adrenocortical activation and hippocampal neurogenesis suppression. Mol. Psychiatry 13, 717–728 (2008).

2. Zhou, Q. G. et al. Hippocampal telomerase is involved in the modulation of depressive behaviors. J. Neurosci.31, 12258–12269 (2011).

3. Sobrian, S. K., Marr, L. & Ressman, K. Prenatal cocaine and/or nicotine exposure produces depression and anxiety in aging rats. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 27, 501–518 (2003).

4. Huang, H. J. et al. Ghrelin alleviates anxiety- and depression-like behaviors induced by chronic unpredictable mild stress in rodents. Behav. Brain Res. 326, 33–43 (2017).

5. Liu, M. Y. et al. Sucrose preference test for measurement of stress-induced anhedonia in mice. Nat Protoc 13, 1686-1698, doi:10.1038/s41596-018-0011-z (2018).

6. Schalla, M. A. et al. Sucrose Preference and Novelty-Induced Hypophagia Tests in Rats using an Automated Food Intake Monitoring System. J Vis Exp, doi:10.3791/60953 (2020).