请教PCR高手解答电泳结果，分析错误原因

九哥九嫂 2016-12-29 10:34:36 431 浏览

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a520131400701 2016-12-30 00:00:00

1. 从血液中提取核酸，不能用肝素作抗凝剂，否则会影响后续的PCR反应，建议使用ACD抗凝剂，具体配方可网上百度，只需柠檬酸、柠檬酸钠和NaAc（好像是这三样，记不清了）。 2. 楼主没说清楚你是做的是普通的PCR（模板DNA）还是RT-PCR（模板RNA）。既然是公司提取的模板，PCR结果一般情况下应该不会受DNA的影响，如果是RT-PCR，质量再好的RNA再使用前都应该跑电泳看看有没降解，而且建议RNA分装保存，避免反复冻融。如果使用前保存完好，应该也不会影响到实验结果。 3. 从diyi张图中可以看出，你做PCR的手法也许还不够熟练。在混合PCR反应体系时，若你是在同一管中混匀所有组分，再分装到不同PCR管中，同样的条件应该出现同样的结果，如果结果不同则表明可能PCR仪不够稳定，相同温度下不同孔的温度差异较大；若你是在各个PCR管中分别混合PCR体系不同组分的话，同样的条件出现不同的结果可能的原因就比较难分析了，但手法不熟练可能是Z大的影响因素，也就是说，虽然你在每个PCR管中加入了同样的东西，但是由于你加样时微小的差异导致了各个管中PCR体系的差异，Z后产生了不同的结果，例如图一中左边只有一个出了条带，右边三条带亮度不同（扩增出的量不同，与模板、引物加的多少有关），例如图二中147、258、369之间的巨大差异，还有就是图一右半边和图二456同样条件出现的完全不同的结果。这种情况下需要先使用diyi种方法混匀再分装，保证每管中的PCR体系相同，再寻找其他原因。 4. 梯度PCR不是以1度为梯度的PCR，如果你用梯度PCR设计梯度的话，你会发现，随着你设置的退火温度范围不同，每个梯度温度都会有改变，而且是不规律的，这都是仪器自己设定的，你可以根据自己的实验需要调整温度范围，直至出现满意的温度为止。所以虽然你第二次实验只是在diyi次实验的基础上简单增减了1度，却出现了很不可思议的结果。其实有些敏感的引物，退火温度变化零点几度结果可能就是有和无的差别了。 5. Taq酶和引物没有你想象的那么脆弱。试剂公司的人曾跟我讲过，他们检测一种新研制的taq酶时都是室温放置一天后在做PCR看效果如何的，如果没什么变化就算合格，可见你的taq酶如果是新的又没污染什么蛋白酶之类的东西应该是没问题的。引物就更稳定了，以前我借师姐的引物做PCR，她自己用都是合成回来直接全部溶解，然后直接放在1.5的离心管里，随时冻融了就用，她用完都放了一年半载了，我再拿来用依然没问题，出来的条带还很漂亮，所以你再怎么反复冻融都不会影响引物的，除非你的引物污染了DNA酶等。 6. 图二中Z下面的肯定是引物二聚体了，出现这个东西Z大的可能性就是你加入的引物过多了。建议下次适当减少用量，一般加1ul就不少了，如果你加1ul还是有就试试0.5或0.3吧。还可以等PCR仪的温度上到80度以上再把PCR管放进去，这样高温的条件下就可以避免diyi轮循环时大量的引物二聚体形成了。还有就是延伸时间太长也容易出引物二聚体，尤其是Z后一次延伸，可以适当缩短些时间试试。50bp附近的条带看起来像非特异扩增片段，因为每一个泳道上都出现这一条带了。有可能是你这个引物的特异性不是很好，也可能这个温度范围容易造成非特异带的产生。建议你先做一个55到65的梯度，找出非特异带Z少的范围，再做梯度，逐步缩小退火温度范围。如果实在没有非特异带少的温度范围，那么考虑重新设计引物。如果你的PCR产物只是用来验证某一实验结果，不做后续研究用，那么有一条非特异条带也可以。如果还要做其他的研究用，Z好没有非特异带，或者做胶回收，把目的片段回收了，除去非特异带的干扰。 7. Maker跑成W型不要紧，只要跑开了就可以了啊。以后可以尽量把maker点在中间，这样跑出来会很漂亮。依我看，图二中245689都有条带，只是清晰度的差别很大，这是照片的问题，可以在拍照时调整一下亮度对比度什么的，让自己先看清条带再拍照。梯度PCR仪其实并不复杂，找个会用的人教你一下就ok啦。 8. 个人认为用2.0%的胶，130V跑50min没啥问题，就算是RT-PCR产物也无妨，因为PCR的产物都是DNA，不存在RNA降解的可能性。不过看图二的样子，少跑十来分钟应该也可以，只要maker跑开了就可以了，不用跑的离点样空那么远。祝实验顺利。

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